棉花ghzfp1鋅指蛋白基因的克隆及功能分析

棉花ghzfp1鋅指蛋白基因的克隆及功能分析

鈣指蛋白是生物中廣泛存在的一個蛋白質(zhì)家族。20多年來，人們對磷指蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進行了大量研究，并證明了磷指蛋白參與了整個生物體生長發(fā)育的過程。目前發(fā)現(xiàn)的錫指蛋白有10多種，包括c1h2、2ch、c1c2、c3c、c3h4和lcc。其中，lcc-鋅指蛋白包含三個半胱氨酸和一個由氨基酸組成的鋅指結(jié)構(gòu)。到目前為止，已經(jīng)在字母、植物、動物和人類中找到了這種鋅指序列的存在，但對這種蛋白質(zhì)的研究相對較少。根據(jù)最近的研究，預(yù)計南海棠的糖指數(shù)蛋白pei1、hu1和fes1參與了作物胚胎的形成、花的發(fā)育規(guī)則以及南海棠冬生動物特征的形成過程。甘露醇等。根據(jù)研究，由于第一階段轉(zhuǎn)移水稻的過度遷移，如gassypiumcinos基因的過渡性和抗病性得到了顯著改善，但具體的作用機制尚不清楚。在本研究中，我們使用了祖母雙雜交技術(shù)來分離和確定與ghsfp1（gossypiumbirrutan）相互作用的蛋白質(zhì)，這為闡明戈斯提蛋白在植物抗逆性中的抗逆性機制提供了重要線索。1材料和方法1.1實驗載體和試劑棉花(Gossypiumhirsutum)為中棉所19號,由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花所提供.本生煙(Nicotianabenthamiana)為本實驗室保存.大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、載體pBI-GhZFP1、HAP-5-pSPYCE-35S、pSPYNE-35S、pSPYCE-35S、bZIP63-pSPYNE-35S和bZIP63-pSPYCE-35S為本實驗室保存,克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司,誘餌表達載體pGBKT7、pGADT7、酵母菌株AH109、Y187購自Clontech公司.酵母雙雜交試劑盒BDMatchmakerTMLibraryConstruction&ScreeningKits、酵母培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化試劑購自Clontech公司.mRNA分離試劑盒購自Qiagen公司.酵母質(zhì)粒提取試劑盒(DP112-02)購自TIANGEN公司.DNA重組所用各種酶、DNAmarker、膠回收純化試劑盒、LB培養(yǎng)基胰化蛋白胨和酵母提取物購自TaKaRa公司,引物合成和測序由上海生物工程公司完成.1.2ctcgt-ccac以質(zhì)粒pBI-GhZFP1為模板,設(shè)計一系列特異性引物.引物1:GAATTCATGACCACTGTTTATGACCC;引物2:CTGCAGCATCAAGAGCTCATTAAC-CCAC;引物3:CTGCAGCCTTGGTGTTCTTTGCTGGTGT;引物4:GAATTCAAGAACTATAACCATTGCT-GC;引物5:CTGCAGCTACATCAAGAGCTCATTA-AC;分別用引物1-2,1-3,4-5進行編碼GhZFP1全長、N端1-237氨基酸區(qū)域(m1)及C端238-339氨基酸區(qū)域(m2)的PCR擴增,連到pMD18-T克隆載體,再用EcoRⅠ和PstⅠ酶切位點進行酶切,定向亞克隆到酵母載體pGBKT7中,經(jīng)酶切和測序驗證.1.3分離培養(yǎng)4個知識品種的半乳糖苷酶活性檢測采用LiAc轉(zhuǎn)化法分別將載體pGBKT7-Lam,pGBKT7-53,pGBKT7-GhZFP1,pGBKT7-m1,pGBKT7-m2及空載體pGBKT7轉(zhuǎn)化酵母菌Y187和AH109.將轉(zhuǎn)化的菌體分別涂布相應(yīng)SD/-His/Trp/X-α-Gal或SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal平板,30℃培養(yǎng)1周,觀察菌落生長情況,對其進行β-半乳糖苷酶活性檢測.將轉(zhuǎn)化pGBKT7-m1和空載體pGBKT7酵母細胞分別在SD/-Trp/Kan(20μg/ml)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-24h,測定培養(yǎng)液的A600,進行誘餌蛋白的毒性檢測.1.4菌株的篩選和序列分析按CLONTECH公司酵母雙雜交操作手冊進行.首先構(gòu)建鹽脅迫誘導棉花葉片cDNA文庫,之后將其轉(zhuǎn)化到酵母菌Y187,再將pGBKT7-m1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母菌AH109,利用Mating法篩選與GhZFP1相互作用蛋白質(zhì),并按照操作要求測定雜交效率和雜交克隆數(shù)以確保篩選文庫規(guī)模.之后將生長的轉(zhuǎn)化子進行1輪SD/-Leu/-Trp/-His培養(yǎng)皿和2輪SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal培養(yǎng)皿篩選,再挑取生長良好、深藍色克隆提取酵母質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α.然后采用菌落PCR方法進行初篩,再用酶切方法排除相同克隆.將篩選出的每個cDNA融合質(zhì)粒分別與pGBKT7-m1共轉(zhuǎn)化入酵母AH109株進行回轉(zhuǎn)驗證,最后選取呈現(xiàn)明顯藍色的陽性克隆質(zhì)粒用T7引物直接進行核苷酸序列測定,利用GenBank的數(shù)據(jù)庫資源,用BLAST進行序列分析.1.5速度型pp-5和bcip33s的檢測雙分子熒光檢測參考Walter等方法進行.將GhZFP1的N端m1和GZIRD19A去掉終止子的cDNA片段分別克隆到pSPYNE-35S和pSPYCE-35S載體.以HAP-5-pSPYCE-35S、pSPYCE-35S載體作為陰性對照,以bZIP63-pSPYNE-35S和bZIP63-pSPYCE-35S載體作為陽性對照,分別將這些載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101,再侵染一月齡本生煙葉片背面,隔2～3d后取下表皮觀察熒光.2結(jié)果2.1誘變劑的篩選棉花CCCH型鋅指蛋白GhZFP1全長339個氨基酸,為分離與其相互作用的蛋白.將其全長基因、N端1-237氨基酸區(qū)域(m1)及C端238-339氨基酸區(qū)域(m2)的DNA片段分別用特異性引物擴增(Fig.1),并克隆到pGBKT7載體上,命名為pGBKT7-GhZFP1、pGBKT7-m1和pGBKT7-m2.限制性內(nèi)切酶和測序分析表明,構(gòu)建的3種誘餌載體正確.2.2pgbkt7-m1和pgbkt7-m1對酵母雙雜交的影響將誘餌蛋白載體pGBKT7-GhZFP1,pGBKT7-m1,pGBKT7-m2及空載體pGBKT7分別轉(zhuǎn)化AH109酵母菌,涂布SD/-His/Trp/X-α-Gal或SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)板,培養(yǎng)1周.結(jié)果發(fā)現(xiàn),含pGBKT7-GhZFP1和pGBKT7-m2載體的轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)板上生長良好,并且在很短的時間內(nèi)變?yōu)樗{色,而含pGBKT7-m1及空載體pGBKT7的轉(zhuǎn)化子不能生長(Fig.2,見第427頁,彩版),表明pGBKT7-m1在該酵母雙雜交系統(tǒng)中無自身激活作用,可以用于文庫篩選.再將轉(zhuǎn)化pGBKT7-m1和pGBKT7載體的酵母菌分別在SD/-Trp/Kan液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,觀察發(fā)現(xiàn)pGBKT7-m1轉(zhuǎn)化菌株生長良好,與pGBKT7轉(zhuǎn)化菌株生長速度無明顯差異.二者A600比較接近且都大于0.8,說明誘餌載體pGBKT7-m1對酵母細胞沒有毒性,可以直接用于酵母雙雜交文庫篩選.2.3陽性克隆的獲得、分析和分子鑒定以pGBKT7-m1載體為誘餌蛋白,采用酵母共轉(zhuǎn)化方法篩選鹽誘導棉花幼苗葉片cDNA文庫,共篩選了6×106個克隆.將轉(zhuǎn)化子經(jīng)1輪SD/-Leu/-Trp/-His培養(yǎng)板和2輪SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal培養(yǎng)板篩選,再進行β-半乳糖苷酶活性測定,獲得64個陽性克隆.之后用菌落PCR方法進行初篩(Fig.3).將獲得陽性克隆提取質(zhì)粒,再利用酶切方法進行鑒定,得到25個陽性克隆(Fig.4).將篩選出的每個cDNA融合質(zhì)粒分別與pGBKT7-m1共轉(zhuǎn)化入酵母AH109菌株進行回轉(zhuǎn)驗證,以進一步排除假陽性克隆.最后選取呈現(xiàn)明顯藍色的陽性克隆質(zhì)粒進行核苷酸序列測定,通過測序分析及與GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比較,合并序列完全相同的克隆,并剔除載體的閱讀框與目的基因不同的克隆,獲得9個不同類別的基因(Table1).這些基因分別為RING-type鋅指蛋白、RISP、RD21A、β-淀粉酶、RD19A等基因在棉花中的同源性基因,分別參與了泛素化、電子傳遞、蛋白代謝等過程.通過分析這些靶蛋白的已知功能,為研究GhZFP1鋅指蛋白的未知生物學功能提供重要信息.并且這是首次在棉花中獲得這些靶蛋白基因序列,目前尚未有相關(guān)的研究報道.2.4對煙草細胞的熒光檢測為進一步驗證GhZFP1與靶蛋白Y9(GhZFP1interactingandresponsivetodehydrationprotein19A,命名為GZIRD19A)的相互作用,將GhZFP1的N端區(qū)域m1與黃色熒光蛋白的N末端融合,GZIRD19A與黃色熒光蛋白的C末端融合,分別將融合載體、陽性和陰性對照載體,連同沉默抑制子P19共侵染本生煙.結(jié)果發(fā)現(xiàn),共轉(zhuǎn)化m1-pSPYNE-35S和GZIRD19A-pSPYCE-35S載體的煙草細胞核和細胞質(zhì)中均檢測到熒光,說明GhZFP1和GZIRD19A在細胞核和細胞質(zhì)中都能相互作用.而轉(zhuǎn)化陽性對照載體bZIP63-pSPYNE-35S和bZIP63-pSPYCE-35S的煙草細胞,只在細胞核中檢測到熒光;轉(zhuǎn)化陰性對照載體HAP-5-pSPYCE-35S和空載體的煙草細胞中沒有檢測到熒光(Fig.5,見第427頁,彩版).3ghsfp1分子機制的初步探索GhZFP1是我們首次從棉花中分離的一種CCCH型鋅指蛋白.初步研究表明,過量表達該基因的轉(zhuǎn)基因植物耐鹽性和抗病性都有顯著提高,說明GhZFP1蛋白在提高植物抗逆性方面發(fā)揮了重要作用.但作為一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白,其提高植物耐性的具體分子機制和其它方面的生物學功能還不清楚.酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白質(zhì)間相互作用的有效分子生物學方法,在分析新基因的生物學功能和發(fā)現(xiàn)新的作用蛋白質(zhì)方面有著廣泛應(yīng)用[10～12].在本研究中,我們成功地利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到了與GhZFP1蛋白相互作用的9個靶蛋白,通過對這些靶蛋白的分析,不僅對GhZFP1提高植物抗逆性的分子機理有所了解,還為探索GhZFP1蛋白的未知生物學功能提供了新線索..由此推測,GhZFP1可能通過與半胱氨酸蛋白酶的直接作用在調(diào)控植物抗逆性方面發(fā)揮了重要作用.這一發(fā)現(xiàn)為揭示GhZFP1蛋白提高轉(zhuǎn)基因植株抗逆性的分子機理提供了重要信息.此外,靶蛋白Y6與植物病程相關(guān)蛋白家族的類甜味蛋白基因PR5同源性也高達61.2%.而前人研究結(jié)果顯示,PR5類蛋白可能通過與質(zhì)膜的特異作用造成膜穿孔,誘導了真菌細胞膜的滲漏,從而參與植物對真菌的誘導響應(yīng)過程.本研究結(jié)果揭示該類蛋白與GhZFP1蛋白存在相互作用.盡管PR5類蛋白確切的生物學功能尚不清楚,兩者之間具體的分子調(diào)控機制也有待研究,但這一發(fā)現(xiàn)至少為探索GhZFP1和PR5類蛋白的未知生物學功能提供了重要線索.近年來的研究表明,鋅指之間可以互相作用,鋅指蛋白之間或與其它蛋白之間可以相互影響.Mackay等研究了不同鋅指的相互作用,發(fā)現(xiàn)GATA-1在CCCC區(qū)域與它自身、在鋅指1(F1)區(qū)域與Fog鋅指、在F1或F2區(qū)域與EKLF、在F1-2區(qū)域與RBTN2/LMO2均存在相互作用.本研究篩選到的Y1靶蛋白與擬南芥NP＿176722同源性高達66%,屬于RING-type鋅指蛋白家族,包含典型的ZnF＿RBZ結(jié)構(gòu)域.大量研究結(jié)果表明,RING-type鋅指蛋白主要參與泛素化的信號傳遞過程,通過結(jié)合RanGDP和特異泛素-蛋白酶體途徑,可以高效并選擇性地降解