堿性亮氨酸鏈bzp1基因的轉錄調控與作用機理

堿性亮氨酸鏈bzp1基因的轉錄調控與作用機理

氨基酸堿鏈bzp（基本le歷性鎖）是植物中的一個非常重要的預測因素家族。擬南紹有75個家族。它們具有以下共同特點：納入與特定dna序列相結合的堿性結構域；具有負載量作用的亮氨酸鏈的堿性區(qū)域與堿性區(qū)域密切相關。以二聚體二聚體形式的dna；乙烷鏈納米段的堿性區(qū)域與dna直接結合。bZIP類轉錄因子在植物生長發(fā)育、光形態(tài)建成、光信號傳導以及抗逆境脅迫過程中起重要的作用.研究表明,AtbZIP10通過與其它bZIP類轉錄因子(AtbZIP53、AtbZIP9、AtbZIP25)相互作用調節(jié)脯氨酸脫氫酶基因(prolinedehydrogenase,proDH)和種子成熟基因(seedmaturationgenes,MAT)的表達,最終調控植物的生長發(fā)育和種子的成熟[6~8].ABI5和ABI3參與ABA信號傳導途徑,并在種子成熟和萌發(fā)中發(fā)揮著重要的作用.bZIP類轉錄因子與植物非生物脅迫應答密切相關,擬南芥A亞家族(ABF1、ABF2/AREB1、ABF3、ABF4/AREB2),F亞家族(AtbZIP24)等都通過ABA依賴途徑或ABA非依賴途徑調控擬南芥對非生物脅迫的耐性[12~14].水稻OsbZIP72和OsbZIP23基因能夠提高水稻對鹽和干旱脅迫的抗性;大豆GmbZIP132基因超量表達使轉基因擬南芥對低溫、高鹽的耐性較野生型明顯提高.bZIP類轉錄因子HY5參與植物的光形態(tài)建成.在黑暗條件下,COP1(植物光形態(tài)建成調控因子)在細胞核內積累,HY5與其相互作用,并調控其降解.而在光下,COP1從細胞核內轉移到細胞核外,使HY5在細胞核內積累,與查爾酮合成酶基因(CHS)等光誘導基因啟動子特異性結合,正調控相關基因的表達,啟動光形態(tài)建成.目前,對bZIP相互作用蛋白的研究還比較少,而蛋白質互相作用對研究基因信號傳導通路與調控機制具有重要作用.本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng),以無激活特性的AtbZIP1(Arabidopsisthalianabasicleucinezipper1)缺失突變體AtbZ3為誘餌蛋白,構建擬南芥cDNA文庫,篩選AtbZIP1相互作用蛋白.經序列分析發(fā)現(xiàn)包括葉綠體ATP合成酶CF0亞基,組氨酸磷酸轉移激酶AHP2,過氧化氫酶CAT2,Gly富含蛋白GPR2,bHLH家族轉錄因子.亞細胞定位分析表明,AtbZIP1除了定位于細胞核外,還定位于葉綠體.由此推論,AtbZIP1基因可能參與光信號傳導和非生物脅迫等生物學過程,為進一步研究AtbZIP1轉錄因子基因的功能及其分子機制奠定了基礎.1材料和方法1.1主要試劑和儀器酵母AH109菌株、Y2H菌株、pGBKT7和pGADT7-Rec質粒購自Clontech公司,大腸桿菌DH5α菌株和亞細胞定位載體pCEF、原核表達載體pET32b由東北農業(yè)大學植物生物工程研究室保存.雙雜交文庫構建系統(tǒng)(MakeYourOwn“Mate&PlateTM”LibrarySystem)、酵母雙雜交系統(tǒng)(MatchmakerTMGoldYeastTwo-HybridSystem)、AureobasidinA(AbA)購自Clontech公司,酵母質粒提取試劑盒(TIANprepyeastplasmidDNAkit)和總RNA提取試劑盒(plantRNAprepPlantKit)購自北京天根生化公司,總RNA提取試劑盒(RNeasyPlantMiniKit)購自Qiangen公司,ReverseTranscriptaseM-MLVRNaseH-,PrimerStar高保真酶,限制性內切酶和連接酶等分子生物學試劑購自TaKaRa公司,PCR引物合成及測序由上海生工生物公司完成.1.2擴增atbcip1基因回復突變體的構建采用濾紙橋培養(yǎng)法培養(yǎng)擬南芥幼苗,培養(yǎng)22d后,采用plantRNAprepPlantKit試劑盒提取幼苗總RNA,并通過ReverseTranscriptaseM-MLVRNaseH-試劑盒反轉錄合成cDNA模板.用基因特異引物(5′-TTTCCATGGTTATGGCAAACG-3′和5′-AAAGAGCTCCTTGTCTTAAAGGACG-3′)通過高保真聚合酶PrimerstarPCR擴增AtbZIP1基因CDS區(qū)(435bp),同時在其兩端引入NcoⅠ和SacⅠ酶切位點,將PCR產物回收,并與pET32b載體同時進行雙酶切,酶切產物回收后采用T4DNA連接酶連接過夜,并轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,PCR鑒定得到陽性轉化子.在pET32b載體HIS6標簽后設計引物(5′-AAACTGCAGGTGGTGGTGGTG-3′),PCR擴增獲得含有HIS6的AtbZIP1基因,并與NcoⅠ和PstⅠ酶切后的pGBKT7載體連接,轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,將PCR鑒定正確的轉化子進一步酶切鑒定并送交測序.1.3菌落生長測定將構建的pGBKT7-AtbZIP1質粒和pGBKT7空載體分別轉化AH109酵母感受態(tài)細胞,PCR檢測質粒是否轉化成功.挑取直徑>2mm、PCR陽性的單菌落接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基,30℃振蕩培養(yǎng)(250r/min)過夜,將菌液稀釋1000倍,涂布于SD/-Trp固體培養(yǎng)基上,觀察pGBKT7-AtbZIP1和pGBKT7空載體菌落生長狀況.挑取陽性克隆,分別在SD/-Trp和SD/-Trp-His固體培養(yǎng)基上劃線,觀察菌落生長狀況.并進一步用藍白斑篩選試驗,確定誘餌蛋白是否具有自激活.1.4pcr產物的分離和鑒定以pGBKT7-AtbZIP1質粒為模板,設計缺失突變引物分別在其兩端引入NcoⅠ和PstⅠ酶切位點bZ1(5′-AAACCATGGACATAGATGAGAAGA-3′和5′-AAACTGCAGATGTCTTAAAGGAC-3′)、bZ2(5′-AAACCATGGAGTTAATGGAAGAC-3′和5′-AAACTG-CAGATGTCTTAAAGGAC-3′)、bZ3(5′-TTTCCATG-GTTATGGCAAACG-3′和5′-AAACTGCAGTCTCTA-AATCGCTAAC-3′),將PCR產物回收后進行雙酶切回收,并與酶切后的pGBKT7載體16℃連接過夜,轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,并進行PCR和酶切鑒定,將鑒定正確的轉化子送交測序.1.5誘導蛋白的鑒定與鑒定將pGBKT7-AtbZ1/bZ2/bZ3轉化AH109酵母感受態(tài)細胞,PCR鑒定獲得陽性轉化子.挑取各缺失突變體、陽性對照、陰性對照及全長序列陽性克隆,分別在SD/-Trp和SD/-Trp-His固體培養(yǎng)基上劃線,觀察菌落生長狀況.并進一步用藍白斑篩選試驗,確定誘餌蛋白的轉錄激活區(qū)域.1.6y2h酵母分離菌株的構建采用Clontech公司最新的酵母雙雜交系統(tǒng)(MatchmakerTMGoldYeastTwo-HybridSystem)進行酵母雙雜交篩選.其中采用的Y2H酵母菌株區(qū)別于AH109酵母菌株的特點在于其具有1個AUR1(編碼酵母inositolphosphorylceramidesynthase)突變的AUR1-C報告基因.在釀酒酵母菌Saccharomycescerevisiae中,突變的AUR1-C可以提供AureobasidinA(AbA)抗性,該酵母特異的抗生素篩選標記可以在很低的濃度即可殺死酵母細胞,無需特異的優(yōu)化.采用LiAc/PEG法,將pGBKT7-AtbZ3質粒轉化Y2H酵母感受態(tài)細胞,PCR鑒定獲得陽性轉化子,挑取陽性菌落接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基,30℃振蕩培養(yǎng)(250r/min)過夜,存菌用于后續(xù)的雙雜交篩選.1.7抗c-同型抗體的制備采用玻璃珠法,分別提取空酵母菌(Y2H)和含有pGBKT7-AtbZ3質粒的酵母總蛋白,加入5×上樣緩沖液,混勻后煮沸10min,經SDS后,采用真空轉印儀將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上,用封閉液封閉1h,與抗c-Myc標簽鼠單克隆抗體4℃過夜雜交,然后與連接有辣根過氧化物酶的兔抗鼠IgG單克隆抗體孵育45min,化學發(fā)光底物法顯色,檢測雜交信號.1.8sscdna的構建采用RNeasyPlantMiniKit試劑盒提取擬南芥幼苗總RNA,采用SMARTMMLVReverseTranscriptase,以CDSⅢPrimer和SMARTⅢOligo反轉錄合成cDNA第1鏈,并通過Advantage2PolymeraseLD-PCR擴增合成dsDNA,最后通過CHROMASPINTMTE-400柱純化回收大于300bp的DNA片段.將回收后的dsDNA與線性化的pGADT7-rec共轉化已含有pGBKT7-AtbZ3質粒的Y2H酵母感受態(tài)細胞,將轉化細胞涂布于SD/-TrpLeu-His-Ade+60mg·L-1AbA固體培養(yǎng)基上,篩選獲得陽性克隆.PCR鑒定陽性克隆并將PCR產物送交測序,分析測序結果.挑取感興趣的目的蛋白,將其對應的陽性克隆接種于SD/-Trp-Leu-His-Ade液體培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)過夜,將菌液分別稀釋10、100和1000倍,取1μL點至SD/-Trp-Leu-HisAde+100mg·L-1AbA固體培養(yǎng)基上,觀察菌落生長狀況.1.9陽性克隆的獲得采用TIANprepyeastplasmidDNAkit提取陽性克隆的質粒,轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α,經過LB/Amp培養(yǎng)基篩選和PCR鑒定獲得陽性轉化子,提取質粒,與pGBKT7-AtbZ3共轉化AH109酵母感受態(tài)細胞,經過將轉化細胞涂布于SD/-Trp-Leu-HisAde篩選和PCR鑒定獲得陽性克隆,接種于SD/-Trp-Leu液體培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)過夜,將菌液稀釋100倍,取1μL點至SD/-Trp-Leu和SD/-TrpLeu-His固體培養(yǎng)基上,觀察菌落生長狀況,并用藍白斑實驗進一步驗證.1.10陽性轉化子的制備將AtbZIP1基因從pGBKT7-AtbZIP1載體上NcoⅠ和SacⅠ酶切后回收,與pCEF載體(本實驗室構建的亞細胞定位載體)16℃過夜連接,轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,將鑒定正確的轉化子送交測序.將測序正確的pCEF-AtbZIP1轉化農桿菌EHA105,將陽性轉化子接種于含有50mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中,28℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(A600=0.6),6000r/min離心1min收集菌體;用無菌水重懸浮,調整菌液濃度使其A600約為1.0,離心后用緩沖液重懸,于4℃放置3h后,用1mL注射器針頭在煙草葉片背部刺2~3個小孔,一手按住葉面小孔處,一手用無針頭的針管將菌液沿小孔慢慢注入葉片組織空隙中.25℃培養(yǎng)3d后于激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP熒光信號.2結果2.1pet32b-atbcip1中間載體的構建提取擬南芥幼苗總RNA后,反轉錄合成cDNA模板.用高保真的Primerstar聚合酶PCR擴增AtbZIP1基因的全長CDS區(qū)(435bp),構建了pET32b-AtbZIP1中間載體.在pET32b載體HIS6標簽后設計引物,PCR擴增獲得含有HIS6的AtbZIP1基因,經NcoⅠ和PstⅠ酶切后與pGBKT7載體連接,酶切鑒定結果正確,將該載體命名為pGBKT7-AtbZIP1,測序結果與該基因序列一致.2.2ah109酵母細胞的表達采用LiAc/PEG法,將pGBKT7和pGBKT7-AtbZIP1分別轉化AH109酵母感受態(tài)細胞,接種在SD/-Trp培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)3d,發(fā)現(xiàn)pGBKT7-AtbZIP1轉化菌株生長良好,菌落呈白色,直徑大于2mm,生長速度與pGBKT7轉化菌株無明顯差異,表明AtbZIP1蛋白對AH109酵母菌沒有毒性作用.經PCR鑒定獲得陽性轉化子.AtDREB1C在酵母體內具有自激活能力,將pGBKT7-AtDREB1C同時轉化AH109酵母細胞,作為陽性對照.分別將各陽性轉化子在SD/-Trp和SD/-Trp-His培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),培養(yǎng)結果如Fig.1A所示,所有酵母細胞都能夠在SD/-Trp培養(yǎng)基上正常生長(Fig.1B);含有pGBKT7-AtbZIP1和陽性對照pGBKT7-AtDREB1C的酵母細胞,可以在SD/-Trp-His選擇培養(yǎng)基上生長,而陰性對照則不能正常生長(Fig.1C).說明AtbZIP1具有自激活能力,可以激活下游報告基因HIS的表達.β-半乳糖苷酶藍白斑檢測實驗結果表明,含pGBKT7-AtbZIP1的酵母細胞和陽性對照pGBKT7-AtDREB1C能夠產生藍斑,而陰性對照則不能產生藍斑(Fig.1D),進一步說明AtbZIP1在酵母體內具有轉錄激活特性.2.3酵母細胞在sd/-trp培養(yǎng)基上的生長以pGBKT7-AtbZIP1質粒為模板,PCR擴增AtbZIP1基因的各缺失片段(Fig.2A,B),與pGBKT7載體連接,酶切鑒定結果正確(Fig.2C),將缺失載體分別命名為pGBKT7-AtbZ1、pGBKT7-AtbZ2、pGBKT7-AtbZ3,測序結果與該基因序列一致.將構建好的上述載體分別轉化AH109酵母感受態(tài)細胞,PCR獲得陽性轉化子(Fig.2D).將轉化子分別在SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-LeuHis培養(yǎng)基上劃線(Fig.3A).結果表明,所有酵母細胞都能夠在SD/-Trp培養(yǎng)基上正常生長(Fig.3B);含有pGBKT7-AtbZIP1/bZ1和陽性對照pGBKT7-AtDREB1C的酵母細胞可以在SD/-Trp-Leu-His選擇培養(yǎng)基上生長,而pGBKT7-AtbZ2/bZ3和陰性對照pGBKT7則不能正常生長(Fig.3C),表明缺失突變AtbZ1仍然具有轉錄激活能力,而AtbZ2和AtbZ3則喪失了激活特性,說明AtbZIP1基因N端13~38氨基酸殘基以及C端93~145氨基酸殘基在AtbZIP1基因激活特性中起重要作用.β-半乳糖苷酶藍白斑檢測實驗進一步驗證了該結果.通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),AtbZ2突變缺失AtbZIP1基因與DNA結合的BR結構域,因此在酵母雙雜交篩選中選用AtbZ3缺失突變體.將pGBKT7-AtbZ3載體轉化酵母Y2H感受態(tài)細胞,并通過PCR鑒定得到陽性轉化子.提取酵母菌體總蛋白,通過Western免疫印跡驗證了pGBKT7-AtbZ3在酵母菌Y2H中能夠正確表達(Fig.4).2.4合成cdna總rna和雙鏈生物酶基因b提取擬南芥幼苗總RNA,電泳檢測RNA的完整性.結果顯示,28SrRNA和18SrRNA條帶清晰,表明所提取擬南芥的總RNA完整性好.將RNA稀釋500倍后進行紫外分光光度計定量檢測,A260約為0.12,其濃度約為1.16g/L,A260/A280比值為1.88.結果表明,RNA純度較高,符合建庫要求.以3μL總RNA為模板,按方法1.8進行反轉錄合成cDNA第1鏈.LD-PCR擴增后進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析,可以觀察到0.3~6kb的彌散狀條帶,說明合成的雙鏈cDNA符合建庫要求.2.5sd/-trp-his-ade檢測酵母細胞系統(tǒng)中雙重元素pa的表達將雙鏈DNA與線性化的pGADT7-rec載體共轉化已含有pGBKT7-AtbZ3的Y2H酵母感受態(tài)細胞.經過SD/-Trp-Leu-His-Ade+60mg/LAbA篩選得到191個克隆,菌落直徑大于2mm.進一步通過PCR鑒定篩選獲得了158個插入片段>300bp的陽性克隆.2.6gly相關蛋白的篩選挑取PCR產物條帶清晰、單一、且大小不同的菌落(106個),將PCR產物送交測序,共得到97條測序結果.將核苷酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比較,去重,結合文獻分析,共篩選出5個感興趣的目的蛋白:葉綠體ATP合成酶CF0亞基(24#),組氨酸磷酸轉移激酶AHP2(Arabidopsishistidinephosphotransferase2,41#),過氧化氫酶CAT2(catalase2,48#),Gly富含蛋白GRP(glycine-richprotein2,51#),bHLH(basic/Helix-Loop-Helix)家族轉錄因子(56#).2.7陽性克隆的篩選將目的菌落搖菌,菌液濃度調整至A260約為0.6后,按1∶10、1∶100和1∶1000進行稀釋,并取菌液1μL滴至SD/-Trp-Leu-His-Ade+100mg/LAbA平板進行30℃培養(yǎng)4d.結果顯示,除陰性對照外,酵母細胞都能正常生長(Fig.5A).提取陽性克隆質粒,并分別將其質粒與pGBKT7-AtbZ3共轉化AH109酵母感受態(tài)細胞,PCR鑒定得到陽性轉化子.將陽性轉化子搖菌,并將其分別取1μL菌液點至SD/-Trp-Leu、SD/-TrpLeu-His平板和濾紙上.將平板放置30℃培養(yǎng)4d.結果表明,在SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-His上,陽性克隆都能正常生長(Fig.5B),該結果與Fig.5A相一致.并且藍白斑結果同樣證明了該結論.綜上所述,通過AbA抗生素,His營養(yǎng)缺陷和LacZ藍白斑3種獨立且不同的檢測方法,分別驗證了篩選得到陽性克隆的準確性,同時降低了假陽性的可能性.2.8p2p亞細胞定位載體為了進一步驗證AtbZIP1與葉綠體ATP合成酶相互作用,將AtbZIP1基因與GFP融合表達,構建了AtbZIP1亞細胞定位載體pCEF-AtbZIP1(Fig.6A,B),并將該載體轉化農桿菌EHA105(Fig.6B).通過農桿菌侵染煙草,GFP瞬時表達分析了AtbZIP1蛋白的亞細胞定位.結果顯示,AtbZIP1蛋白除了在細胞核中定位外,還定位于葉綠體細胞(Fig.6C).該結果表明,AtbZIP1基因可能在光信號傳導等途徑中起到重要的作用.3atbcip1轉錄因子對植物非生物脅迫信號傳導的調控隨著基因功能研究的不斷深入,對功能基因的分子作用機制和信號傳導通路的研究已成為基因功能研究的又一熱點.酵母雙雜交技術,作為研究基因的分子作用機制和信號傳導通路的一種手段,其最大的缺陷即是假陽性率高[21~23].本研究采用Clontech公司最新推出的MatchmakerGoldYeastTwo-HybridSystem雙雜交系統(tǒng),該系統(tǒng)首次應用AUR1-C基因(酵母inositolphosphorylceramidesynthase編碼基因AUR1的突變體)作為一種抗生素(aureobasidinA,AbA)抗性篩選標記基因.區(qū)別于營養(yǎng)缺陷型篩選標記,該標記可以極大的降低假陽性,并且無需特異的優(yōu)化,可以與營養(yǎng)缺陷型篩選同時使用.使用酵母雙雜交系統(tǒng)進行蛋白相互作用研究時,另一個重要的問題是誘餌蛋白的選擇.如果誘餌蛋白選擇合適,就會降低雙雜交過程中的假陽性,方便后續(xù)陽性相互作用的驗證,減少工作量.因此本研究首先驗證了AtbZIP1轉錄因子的自激活特性(Fig.1),并通過缺失突變確定了該基因的轉錄激活區(qū)域(Fig.3).研究結果表明,AtbZ2和AtbZ3缺失突變體都不具有轉錄激活能力,但AtbZ2突變缺失了AtbZIP1與DNA順式作用元件相互作用的堿性結構域,所以以AtbZ3突變體作為誘餌蛋白.在酵母雙雜交研究蛋白質相互作用的技術平臺中,如何構建高質量的cDNA文庫是整個研究的關鍵.在cDNA文庫構建的過程中,植物樣品RNA提取質量至關重要.RNA的純度和完整性決定cDNA文庫的構建質量,即序列的完整性.在雙鏈cDNA合成過程中,要特別注意控制LD-PCR擴增的循環(huán)數(shù),適當?shù)难h(huán)次數(shù)可以防止低拷貝數(shù)的基因丟失及高拷貝數(shù)的基因過分放大.有效去除小于400bp的小片段對cDNA文庫構建也十分重要,否則這些小片段會優(yōu)先與載體重組,導致文庫質量下降.本研究通過對酵母雙雜交篩選并測序得到的97條目的蛋白DNA序列進行Blast比對,篩選出5個候選基因,并在酵母體內分別驗證了其相互作用(Fig.5).為了進一步驗證AtbZIP1蛋白與ATP合成酶的相互作用,進行了AtbZIP1亞細胞定位分析.結果顯示,AtbZIP1蛋白可定位于葉綠體細胞(Fig.6).研究表明,bZIP類轉錄因子H亞族成員(AtbZIP56/HY5和AtbZIP64/HYH),參與光形態(tài)發(fā)生和光信號轉導.其中,HY5可以與啟動子區(qū)中的G-Box結合,調控下游光誘導基因的表達.結合AtbZIP1蛋白與ATP