堿性亮氨酸鏈bzp1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與作用機(jī)理

堿性亮氨酸鏈bzp1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與作用機(jī)理

氨基酸堿鏈bzp（基本le歷性鎖）是植物中的一個(gè)非常重要的預(yù)測因素家族。擬南紹有75個(gè)家族。它們具有以下共同特點(diǎn)：納入與特定dna序列相結(jié)合的堿性結(jié)構(gòu)域；具有負(fù)載量作用的亮氨酸鏈的堿性區(qū)域與堿性區(qū)域密切相關(guān)。以二聚體二聚體形式的dna；乙烷鏈納米段的堿性區(qū)域與dna直接結(jié)合。bZIP類轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、光形態(tài)建成、光信號傳導(dǎo)以及抗逆境脅迫過程中起重要的作用.研究表明,AtbZIP10通過與其它bZIP類轉(zhuǎn)錄因子(AtbZIP53、AtbZIP9、AtbZIP25)相互作用調(diào)節(jié)脯氨酸脫氫酶基因(prolinedehydrogenase,proDH)和種子成熟基因(seedmaturationgenes,MAT)的表達(dá),最終調(diào)控植物的生長發(fā)育和種子的成熟[6~8].ABI5和ABI3參與ABA信號傳導(dǎo)途徑,并在種子成熟和萌發(fā)中發(fā)揮著重要的作用.bZIP類轉(zhuǎn)錄因子與植物非生物脅迫應(yīng)答密切相關(guān),擬南芥A亞家族(ABF1、ABF2/AREB1、ABF3、ABF4/AREB2),F亞家族(AtbZIP24)等都通過ABA依賴途徑或ABA非依賴途徑調(diào)控?cái)M南芥對非生物脅迫的耐性[12~14].水稻OsbZIP72和OsbZIP23基因能夠提高水稻對鹽和干旱脅迫的抗性;大豆GmbZIP132基因超量表達(dá)使轉(zhuǎn)基因擬南芥對低溫、高鹽的耐性較野生型明顯提高.bZIP類轉(zhuǎn)錄因子HY5參與植物的光形態(tài)建成.在黑暗條件下,COP1(植物光形態(tài)建成調(diào)控因子)在細(xì)胞核內(nèi)積累,HY5與其相互作用,并調(diào)控其降解.而在光下,COP1從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核外,使HY5在細(xì)胞核內(nèi)積累,與查爾酮合成酶基因(CHS)等光誘導(dǎo)基因啟動子特異性結(jié)合,正調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá),啟動光形態(tài)建成.目前,對bZIP相互作用蛋白的研究還比較少,而蛋白質(zhì)互相作用對研究基因信號傳導(dǎo)通路與調(diào)控機(jī)制具有重要作用.本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng),以無激活特性的AtbZIP1(Arabidopsisthalianabasicleucinezipper1)缺失突變體AtbZ3為誘餌蛋白,構(gòu)建擬南芥cDNA文庫,篩選AtbZIP1相互作用蛋白.經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)包括葉綠體ATP合成酶CF0亞基,組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移激酶AHP2,過氧化氫酶CAT2,Gly富含蛋白GPR2,bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子.亞細(xì)胞定位分析表明,AtbZIP1除了定位于細(xì)胞核外,還定位于葉綠體.由此推論,AtbZIP1基因可能參與光信號傳導(dǎo)和非生物脅迫等生物學(xué)過程,為進(jìn)一步研究AtbZIP1轉(zhuǎn)錄因子基因的功能及其分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ).1材料和方法1.1主要試劑和儀器酵母AH109菌株、Y2H菌株、pGBKT7和pGADT7-Rec質(zhì)粒購自Clontech公司,大腸桿菌DH5α菌株和亞細(xì)胞定位載體pCEF、原核表達(dá)載體pET32b由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物工程研究室保存.雙雜交文庫構(gòu)建系統(tǒng)(MakeYourOwn“Mate&PlateTM”LibrarySystem)、酵母雙雜交系統(tǒng)(MatchmakerTMGoldYeastTwo-HybridSystem)、AureobasidinA(AbA)購自Clontech公司,酵母質(zhì)粒提取試劑盒(TIANprepyeastplasmidDNAkit)和總RNA提取試劑盒(plantRNAprepPlantKit)購自北京天根生化公司,總RNA提取試劑盒(RNeasyPlantMiniKit)購自Qiangen公司,ReverseTranscriptaseM-MLVRNaseH-,PrimerStar高保真酶,限制性內(nèi)切酶和連接酶等分子生物學(xué)試劑購自TaKaRa公司,PCR引物合成及測序由上海生工生物公司完成.1.2擴(kuò)增atbcip1基因回復(fù)突變體的構(gòu)建采用濾紙橋培養(yǎng)法培養(yǎng)擬南芥幼苗,培養(yǎng)22d后,采用plantRNAprepPlantKit試劑盒提取幼苗總RNA,并通過ReverseTranscriptaseM-MLVRNaseH-試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板.用基因特異引物(5′-TTTCCATGGTTATGGCAAACG-3′和5′-AAAGAGCTCCTTGTCTTAAAGGACG-3′)通過高保真聚合酶PrimerstarPCR擴(kuò)增AtbZIP1基因CDS區(qū)(435bp),同時(shí)在其兩端引入NcoⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn),將PCR產(chǎn)物回收,并與pET32b載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物回收后采用T4DNA連接酶連接過夜,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,PCR鑒定得到陽性轉(zhuǎn)化子.在pET32b載體HIS6標(biāo)簽后設(shè)計(jì)引物(5′-AAACTGCAGGTGGTGGTGGTG-3′),PCR擴(kuò)增獲得含有HIS6的AtbZIP1基因,并與NcoⅠ和PstⅠ酶切后的pGBKT7載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,將PCR鑒定正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步酶切鑒定并送交測序.1.3菌落生長測定將構(gòu)建的pGBKT7-AtbZIP1質(zhì)粒和pGBKT7空載體分別轉(zhuǎn)化AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞,PCR檢測質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)化成功.挑取直徑>2mm、PCR陽性的單菌落接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基,30℃振蕩培養(yǎng)(250r/min)過夜,將菌液稀釋1000倍,涂布于SD/-Trp固體培養(yǎng)基上,觀察pGBKT7-AtbZIP1和pGBKT7空載體菌落生長狀況.挑取陽性克隆,分別在SD/-Trp和SD/-Trp-His固體培養(yǎng)基上劃線,觀察菌落生長狀況.并進(jìn)一步用藍(lán)白斑篩選試驗(yàn),確定誘餌蛋白是否具有自激活.1.4pcr產(chǎn)物的分離和鑒定以pGBKT7-AtbZIP1質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)缺失突變引物分別在其兩端引入NcoⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)bZ1(5′-AAACCATGGACATAGATGAGAAGA-3′和5′-AAACTGCAGATGTCTTAAAGGAC-3′)、bZ2(5′-AAACCATGGAGTTAATGGAAGAC-3′和5′-AAACTG-CAGATGTCTTAAAGGAC-3′)、bZ3(5′-TTTCCATG-GTTATGGCAAACG-3′和5′-AAACTGCAGTCTCTA-AATCGCTAAC-3′),將PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行雙酶切回收,并與酶切后的pGBKT7載體16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,并進(jìn)行PCR和酶切鑒定,將鑒定正確的轉(zhuǎn)化子送交測序.1.5誘導(dǎo)蛋白的鑒定與鑒定將pGBKT7-AtbZ1/bZ2/bZ3轉(zhuǎn)化AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞,PCR鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)化子.挑取各缺失突變體、陽性對照、陰性對照及全長序列陽性克隆,分別在SD/-Trp和SD/-Trp-His固體培養(yǎng)基上劃線,觀察菌落生長狀況.并進(jìn)一步用藍(lán)白斑篩選試驗(yàn),確定誘餌蛋白的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域.1.6y2h酵母分離菌株的構(gòu)建采用Clontech公司最新的酵母雙雜交系統(tǒng)(MatchmakerTMGoldYeastTwo-HybridSystem)進(jìn)行酵母雙雜交篩選.其中采用的Y2H酵母菌株區(qū)別于AH109酵母菌株的特點(diǎn)在于其具有1個(gè)AUR1(編碼酵母inositolphosphorylceramidesynthase)突變的AUR1-C報(bào)告基因.在釀酒酵母菌Saccharomycescerevisiae中,突變的AUR1-C可以提供AureobasidinA(AbA)抗性,該酵母特異的抗生素篩選標(biāo)記可以在很低的濃度即可殺死酵母細(xì)胞,無需特異的優(yōu)化.采用LiAc/PEG法,將pGBKT7-AtbZ3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y2H酵母感受態(tài)細(xì)胞,PCR鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)化子,挑取陽性菌落接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基,30℃振蕩培養(yǎng)(250r/min)過夜,存菌用于后續(xù)的雙雜交篩選.1.7抗c-同型抗體的制備采用玻璃珠法,分別提取空酵母菌(Y2H)和含有pGBKT7-AtbZ3質(zhì)粒的酵母總蛋白,加入5×上樣緩沖液,混勻后煮沸10min,經(jīng)SDS后,采用真空轉(zhuǎn)印儀將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,用封閉液封閉1h,與抗c-Myc標(biāo)簽鼠單克隆抗體4℃過夜雜交,然后與連接有辣根過氧化物酶的兔抗鼠IgG單克隆抗體孵育45min,化學(xué)發(fā)光底物法顯色,檢測雜交信號.1.8sscdna的構(gòu)建采用RNeasyPlantMiniKit試劑盒提取擬南芥幼苗總RNA,采用SMARTMMLVReverseTranscriptase,以CDSⅢPrimer和SMARTⅢOligo反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈,并通過Advantage2PolymeraseLD-PCR擴(kuò)增合成dsDNA,最后通過CHROMASPINTMTE-400柱純化回收大于300bp的DNA片段.將回收后的dsDNA與線性化的pGADT7-rec共轉(zhuǎn)化已含有pGBKT7-AtbZ3質(zhì)粒的Y2H酵母感受態(tài)細(xì)胞,將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于SD/-TrpLeu-His-Ade+60mg·L-1AbA固體培養(yǎng)基上,篩選獲得陽性克隆.PCR鑒定陽性克隆并將PCR產(chǎn)物送交測序,分析測序結(jié)果.挑取感興趣的目的蛋白,將其對應(yīng)的陽性克隆接種于SD/-Trp-Leu-His-Ade液體培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)過夜,將菌液分別稀釋10、100和1000倍,取1μL點(diǎn)至SD/-Trp-Leu-HisAde+100mg·L-1AbA固體培養(yǎng)基上,觀察菌落生長狀況.1.9陽性克隆的獲得采用TIANprepyeastplasmidDNAkit提取陽性克隆的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,經(jīng)過LB/Amp培養(yǎng)基篩選和PCR鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒,與pGBKT7-AtbZ3共轉(zhuǎn)化AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)過將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于SD/-Trp-Leu-HisAde篩選和PCR鑒定獲得陽性克隆,接種于SD/-Trp-Leu液體培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)過夜,將菌液稀釋100倍,取1μL點(diǎn)至SD/-Trp-Leu和SD/-TrpLeu-His固體培養(yǎng)基上,觀察菌落生長狀況,并用藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證.1.10陽性轉(zhuǎn)化子的制備將AtbZIP1基因從pGBKT7-AtbZIP1載體上NcoⅠ和SacⅠ酶切后回收,與pCEF載體(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的亞細(xì)胞定位載體)16℃過夜連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,將鑒定正確的轉(zhuǎn)化子送交測序.將測序正確的pCEF-AtbZIP1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105,將陽性轉(zhuǎn)化子接種于含有50mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中,28℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(A600=0.6),6000r/min離心1min收集菌體;用無菌水重懸浮,調(diào)整菌液濃度使其A600約為1.0,離心后用緩沖液重懸,于4℃放置3h后,用1mL注射器針頭在煙草葉片背部刺2~3個(gè)小孔,一手按住葉面小孔處,一手用無針頭的針管將菌液沿小孔慢慢注入葉片組織空隙中.25℃培養(yǎng)3d后于激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP熒光信號.2結(jié)果2.1pet32b-atbcip1中間載體的構(gòu)建提取擬南芥幼苗總RNA后,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板.用高保真的Primerstar聚合酶PCR擴(kuò)增AtbZIP1基因的全長CDS區(qū)(435bp),構(gòu)建了pET32b-AtbZIP1中間載體.在pET32b載體HIS6標(biāo)簽后設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增獲得含有HIS6的AtbZIP1基因,經(jīng)NcoⅠ和PstⅠ酶切后與pGBKT7載體連接,酶切鑒定結(jié)果正確,將該載體命名為pGBKT7-AtbZIP1,測序結(jié)果與該基因序列一致.2.2ah109酵母細(xì)胞的表達(dá)采用LiAc/PEG法,將pGBKT7和pGBKT7-AtbZIP1分別轉(zhuǎn)化AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞,接種在SD/-Trp培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)3d,發(fā)現(xiàn)pGBKT7-AtbZIP1轉(zhuǎn)化菌株生長良好,菌落呈白色,直徑大于2mm,生長速度與pGBKT7轉(zhuǎn)化菌株無明顯差異,表明AtbZIP1蛋白對AH109酵母菌沒有毒性作用.經(jīng)PCR鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)化子.AtDREB1C在酵母體內(nèi)具有自激活能力,將pGBKT7-AtDREB1C同時(shí)轉(zhuǎn)化AH109酵母細(xì)胞,作為陽性對照.分別將各陽性轉(zhuǎn)化子在SD/-Trp和SD/-Trp-His培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)果如Fig.1A所示,所有酵母細(xì)胞都能夠在SD/-Trp培養(yǎng)基上正常生長(Fig.1B);含有pGBKT7-AtbZIP1和陽性對照pGBKT7-AtDREB1C的酵母細(xì)胞,可以在SD/-Trp-His選擇培養(yǎng)基上生長,而陰性對照則不能正常生長(Fig.1C).說明AtbZIP1具有自激活能力,可以激活下游報(bào)告基因HIS的表達(dá).β-半乳糖苷酶藍(lán)白斑檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,含pGBKT7-AtbZIP1的酵母細(xì)胞和陽性對照pGBKT7-AtDREB1C能夠產(chǎn)生藍(lán)斑,而陰性對照則不能產(chǎn)生藍(lán)斑(Fig.1D),進(jìn)一步說明AtbZIP1在酵母體內(nèi)具有轉(zhuǎn)錄激活特性.2.3酵母細(xì)胞在sd/-trp培養(yǎng)基上的生長以pGBKT7-AtbZIP1質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增AtbZIP1基因的各缺失片段(Fig.2A,B),與pGBKT7載體連接,酶切鑒定結(jié)果正確(Fig.2C),將缺失載體分別命名為pGBKT7-AtbZ1、pGBKT7-AtbZ2、pGBKT7-AtbZ3,測序結(jié)果與該基因序列一致.將構(gòu)建好的上述載體分別轉(zhuǎn)化AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞,PCR獲得陽性轉(zhuǎn)化子(Fig.2D).將轉(zhuǎn)化子分別在SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-LeuHis培養(yǎng)基上劃線(Fig.3A).結(jié)果表明,所有酵母細(xì)胞都能夠在SD/-Trp培養(yǎng)基上正常生長(Fig.3B);含有pGBKT7-AtbZIP1/bZ1和陽性對照pGBKT7-AtDREB1C的酵母細(xì)胞可以在SD/-Trp-Leu-His選擇培養(yǎng)基上生長,而pGBKT7-AtbZ2/bZ3和陰性對照pGBKT7則不能正常生長(Fig.3C),表明缺失突變AtbZ1仍然具有轉(zhuǎn)錄激活能力,而AtbZ2和AtbZ3則喪失了激活特性,說明AtbZIP1基因N端13~38氨基酸殘基以及C端93~145氨基酸殘基在AtbZIP1基因激活特性中起重要作用.β-半乳糖苷酶藍(lán)白斑檢測實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)果.通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),AtbZ2突變?nèi)笔tbZIP1基因與DNA結(jié)合的BR結(jié)構(gòu)域,因此在酵母雙雜交篩選中選用AtbZ3缺失突變體.將pGBKT7-AtbZ3載體轉(zhuǎn)化酵母Y2H感受態(tài)細(xì)胞,并通過PCR鑒定得到陽性轉(zhuǎn)化子.提取酵母菌體總蛋白,通過Western免疫印跡驗(yàn)證了pGBKT7-AtbZ3在酵母菌Y2H中能夠正確表達(dá)(Fig.4).2.4合成cdna總rna和雙鏈生物酶基因b提取擬南芥幼苗總RNA,電泳檢測RNA的完整性.結(jié)果顯示,28SrRNA和18SrRNA條帶清晰,表明所提取擬南芥的總RNA完整性好.將RNA稀釋500倍后進(jìn)行紫外分光光度計(jì)定量檢測,A260約為0.12,其濃度約為1.16g/L,A260/A280比值為1.88.結(jié)果表明,RNA純度較高,符合建庫要求.以3μL總RNA為模板,按方法1.8進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈.LD-PCR擴(kuò)增后進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析,可以觀察到0.3~6kb的彌散狀條帶,說明合成的雙鏈cDNA符合建庫要求.2.5sd/-trp-his-ade檢測酵母細(xì)胞系統(tǒng)中雙重元素pa的表達(dá)將雙鏈DNA與線性化的pGADT7-rec載體共轉(zhuǎn)化已含有pGBKT7-AtbZ3的Y2H酵母感受態(tài)細(xì)胞.經(jīng)過SD/-Trp-Leu-His-Ade+60mg/LAbA篩選得到191個(gè)克隆,菌落直徑大于2mm.進(jìn)一步通過PCR鑒定篩選獲得了158個(gè)插入片段>300bp的陽性克隆.2.6gly相關(guān)蛋白的篩選挑取PCR產(chǎn)物條帶清晰、單一、且大小不同的菌落(106個(gè)),將PCR產(chǎn)物送交測序,共得到97條測序結(jié)果.將核苷酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較,去重,結(jié)合文獻(xiàn)分析,共篩選出5個(gè)感興趣的目的蛋白:葉綠體ATP合成酶CF0亞基(24#),組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移激酶AHP2(Arabidopsishistidinephosphotransferase2,41#),過氧化氫酶CAT2(catalase2,48#),Gly富含蛋白GRP(glycine-richprotein2,51#),bHLH(basic/Helix-Loop-Helix)家族轉(zhuǎn)錄因子(56#).2.7陽性克隆的篩選將目的菌落搖菌,菌液濃度調(diào)整至A260約為0.6后,按1∶10、1∶100和1∶1000進(jìn)行稀釋,并取菌液1μL滴至SD/-Trp-Leu-His-Ade+100mg/LAbA平板進(jìn)行30℃培養(yǎng)4d.結(jié)果顯示,除陰性對照外,酵母細(xì)胞都能正常生長(Fig.5A).提取陽性克隆質(zhì)粒,并分別將其質(zhì)粒與pGBKT7-AtbZ3共轉(zhuǎn)化AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞,PCR鑒定得到陽性轉(zhuǎn)化子.將陽性轉(zhuǎn)化子搖菌,并將其分別取1μL菌液點(diǎn)至SD/-Trp-Leu、SD/-TrpLeu-His平板和濾紙上.將平板放置30℃培養(yǎng)4d.結(jié)果表明,在SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-His上,陽性克隆都能正常生長(Fig.5B),該結(jié)果與Fig.5A相一致.并且藍(lán)白斑結(jié)果同樣證明了該結(jié)論.綜上所述,通過AbA抗生素,His營養(yǎng)缺陷和LacZ藍(lán)白斑3種獨(dú)立且不同的檢測方法,分別驗(yàn)證了篩選得到陽性克隆的準(zhǔn)確性,同時(shí)降低了假陽性的可能性.2.8p2p亞細(xì)胞定位載體為了進(jìn)一步驗(yàn)證AtbZIP1與葉綠體ATP合成酶相互作用,將AtbZIP1基因與GFP融合表達(dá),構(gòu)建了AtbZIP1亞細(xì)胞定位載體pCEF-AtbZIP1(Fig.6A,B),并將該載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105(Fig.6B).通過農(nóng)桿菌侵染煙草,GFP瞬時(shí)表達(dá)分析了AtbZIP1蛋白的亞細(xì)胞定位.結(jié)果顯示,AtbZIP1蛋白除了在細(xì)胞核中定位外,還定位于葉綠體細(xì)胞(Fig.6C).該結(jié)果表明,AtbZIP1基因可能在光信號傳導(dǎo)等途徑中起到重要的作用.3atbcip1轉(zhuǎn)錄因子對植物非生物脅迫信號傳導(dǎo)的調(diào)控隨著基因功能研究的不斷深入,對功能基因的分子作用機(jī)制和信號傳導(dǎo)通路的研究已成為基因功能研究的又一熱點(diǎn).酵母雙雜交技術(shù),作為研究基因的分子作用機(jī)制和信號傳導(dǎo)通路的一種手段,其最大的缺陷即是假陽性率高[21~23].本研究采用Clontech公司最新推出的MatchmakerGoldYeastTwo-HybridSystem雙雜交系統(tǒng),該系統(tǒng)首次應(yīng)用AUR1-C基因(酵母inositolphosphorylceramidesynthase編碼基因AUR1的突變體)作為一種抗生素(aureobasidinA,AbA)抗性篩選標(biāo)記基因.區(qū)別于營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記,該標(biāo)記可以極大的降低假陽性,并且無需特異的優(yōu)化,可以與營養(yǎng)缺陷型篩選同時(shí)使用.使用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行蛋白相互作用研究時(shí),另一個(gè)重要的問題是誘餌蛋白的選擇.如果誘餌蛋白選擇合適,就會降低雙雜交過程中的假陽性,方便后續(xù)陽性相互作用的驗(yàn)證,減少工作量.因此本研究首先驗(yàn)證了AtbZIP1轉(zhuǎn)錄因子的自激活特性(Fig.1),并通過缺失突變確定了該基因的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域(Fig.3).研究結(jié)果表明,AtbZ2和AtbZ3缺失突變體都不具有轉(zhuǎn)錄激活能力,但AtbZ2突變?nèi)笔Я薃tbZIP1與DNA順式作用元件相互作用的堿性結(jié)構(gòu)域,所以以AtbZ3突變體作為誘餌蛋白.在酵母雙雜交研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)平臺中,如何構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫是整個(gè)研究的關(guān)鍵.在cDNA文庫構(gòu)建的過程中,植物樣品RNA提取質(zhì)量至關(guān)重要.RNA的純度和完整性決定cDNA文庫的構(gòu)建質(zhì)量,即序列的完整性.在雙鏈cDNA合成過程中,要特別注意控制LD-PCR擴(kuò)增的循環(huán)數(shù),適當(dāng)?shù)难h(huán)次數(shù)可以防止低拷貝數(shù)的基因丟失及高拷貝數(shù)的基因過分放大.有效去除小于400bp的小片段對cDNA文庫構(gòu)建也十分重要,否則這些小片段會優(yōu)先與載體重組,導(dǎo)致文庫質(zhì)量下降.本研究通過對酵母雙雜交篩選并測序得到的97條目的蛋白DNA序列進(jìn)行Blast比對,篩選出5個(gè)候選基因,并在酵母體內(nèi)分別驗(yàn)證了其相互作用(Fig.5).為了進(jìn)一步驗(yàn)證AtbZIP1蛋白與ATP合成酶的相互作用,進(jìn)行了AtbZIP1亞細(xì)胞定位分析.結(jié)果顯示,AtbZIP1蛋白可定位于葉綠體細(xì)胞(Fig.6).研究表明,bZIP類轉(zhuǎn)錄因子H亞族成員(AtbZIP56/HY5和AtbZIP64/HYH),參與光形態(tài)發(fā)生和光信號轉(zhuǎn)導(dǎo).其中,HY5可以與啟動子區(qū)中的G-Box結(jié)合,調(diào)控下游光誘導(dǎo)基因的表達(dá).結(jié)合AtbZIP1蛋白與ATP