米曲霉蛋白酶主要成分分離及其酶學性質(zhì)研究

米曲霉蛋白酶主要成分分離及其酶學性質(zhì)研究

酶是一種含有可水解蛋白中氨基酸或酪氨酸酶的酶。這是世界上第三個酶制劑之一，占世界酶制劑產(chǎn)量的60%。主要來自動物、植物和微生物。一般來說，雖然它不含有有毒反應，但如果水解反應完成，它將自身死亡。因此，它在食品行業(yè)中得到了廣泛的應用。蛋白酶水解蛋白質(zhì)具有效率高、條件溫和、能提高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值等多項優(yōu)點。不同的蛋白酶有不同的酶切方式,對氨基酸殘基形成的肽鍵有其酶解專一性,因此當不同的蛋白酶作用于同一底物時,會產(chǎn)生不同的氨基酸或小肽水解物,使蛋白水解物具有不同的口味和功能特性。米曲霉是公認的食品安全菌株,具有很強的蛋白酶合成能力,其蛋白酶在較廣的pH范圍內(nèi)均具有活性,另外由于米曲霉含有豐富的糖苷水解酶,可以利用淀粉或纖維素等廉價原料高效生產(chǎn)蛋白酶,所以米曲霉是食品用蛋白酶的主要來源菌株。多年來對米曲霉蛋白酶的研究,主要集中在發(fā)酵過程中蛋白酶活力測定,誘變菌株提高活力等方面。另外,張賀迎等用活性電泳方法分析發(fā)現(xiàn)米曲霉能分泌多種蛋白酶,曾小波等用硫酸銨沉淀、凝膠柱層析方法初步分離出一種內(nèi)肽酶和一種外肽酶,除此很少有關(guān)于米曲霉各蛋白酶組分酶解特性的深入研究,影響了對米曲霉蛋白酶的充分利用。本文對一株米曲霉所產(chǎn)蛋白酶系進行了分離純化,并對獲得的蛋白酶組分進行酶學性質(zhì)及酶解特性研究,為米曲霉所產(chǎn)蛋白酶在食品上的應用提供指導。1材料和方法1.1培養(yǎng)基培養(yǎng)條件1.1.1菌株:米曲霉(Aspergillusoryzae),本研究中心篩選和保藏。1.1.2原料:麩皮、馬鈴薯為市售;大豆分離蛋白購自哈爾濱高科大豆食品有限公司;酪蛋白、牛血清蛋白購自國藥集團化學試劑有限公司。1.1.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件:種子斜面培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200,蔗糖20,瓊脂20;種子培養(yǎng)條件:30°C靜置培養(yǎng)5d。發(fā)酵固體培養(yǎng)基:麩皮與水按1:1(體積比)比例攪拌均勻;發(fā)酵培養(yǎng)條件:接3環(huán)斜面菌種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,充分搖勻,30°C培養(yǎng)36h,24h時扣瓶。1.1.4主要試劑和儀器:DEAE-SepharoseFF、Phenyl-SepharoseHP、Sephadex-G75/200預裝柱,購自Pharmacia公司;低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker,購自TaKaRa公司;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、十二烷基硫酸鈉(SDS)、考馬斯亮藍R250/G250、TEMED,購自Sigma公司;其它試劑均為分析純或生化試劑。AKTA蛋白純化,Purifer系統(tǒng)。1.2酶活的測定1.2.1蛋白酶酶活測定:采用Folin-酚法。1.2.3粗酶液的提取:將發(fā)酵好的培養(yǎng)物按照質(zhì)量體積比1:3加入生理鹽水,37°C搖床振蕩1h,過濾,濾液即為粗酶液。1.2.4硫酸銨鹽析:取一定體積粗酶液,加入硫酸銨粉末至40%飽和度,4°C靜置5h后,8000r/min離心10min,取上清液補加硫酸銨至80%飽和度,4°C靜置過夜,8000r/min離心10min后,沉淀用0.02mol/LTris-HCl(pH7.5)緩沖液溶解。1.2.5DEAE-SepharoseFF陰離子交換層析:透析脫鹽后的沉淀蛋白,加樣于用0.02mol/LTris-HCl(pH7.5)緩沖液平衡的DEAE-SepharoseFF陰離子交換柱,用平衡液充分衡洗,將未掛上柱的蛋白充分洗脫下來(衡洗階段)后,用0.5mol/LNaCl溶液以2.0mL/min的流速進行線性梯度(0-30%)洗脫(洗脫階段),收集濃縮衡洗階段和洗脫階段的酶活組分。1.2.6Phenyl-SepharoseHP疏水層析:將1.2.5中的濃縮酶液與3mol/L硫酸銨溶液等體積混和后加樣于用1.5mol/L硫酸銨溶液平衡好的Phenyl-SepharoseHP疏水柱。用0.02mol/LTris-HCl(pH7.5)緩沖液進行線性梯度(0-100%)洗脫,流速2.0mL/min。收集濃縮酶液,并進行脫鹽處理。1.2.7Superdex-G75/200凝膠層析:用含0.15mol/LNaCl的0.02mol/LTris-HCl(pH7.5)緩沖液平衡凝膠柱,將1.2.6中的濃縮酶液加樣于凝膠柱,平衡液洗脫,流速0.5mL/min。收集酶活峰,即為純酶液。1.2.8純度、相對分子質(zhì)量測定及酶譜檢測:純度和相對分子質(zhì)量測定采用SDS法。酶譜檢測按SDS稍加改進,樣品與上樣緩沖液混合后不經(jīng)煮沸處理,低溫電泳后,脫色搖床上用2.5%TritonX-100振蕩30min以脫去SDS,0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2)洗膠3次后,置于1%酪蛋白溶液(pH7.2磷酸緩沖液配制)中50°C水解60min,染色及脫色。1.2.9酶學性質(zhì):(1)最適作用pH及pH穩(wěn)定性:分別在不同的pH緩沖體系下測定蛋白酶活性,pH3.0-5.0(乙酸鈉緩沖液)、pH6.0-7.0(磷酸鹽緩沖液)、pH8.0-9.0(Tris緩沖液)、pH10-11(Glycine-NaOH),確定最適pH。用不同的緩沖液分別調(diào)節(jié)酶液的pH到3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0,于室溫放置60min,然后分別在最適pH下測酶活,計算相對酶活。(2)最適作用溫度及溫度穩(wěn)定性:分別在不同的溫度(30-70°C)下測定蛋白酶的活性,確定最適溫度。最適pH條件下,將酶液分別于不同溫度(40、50、60°C)保溫30、60、90、120min,測定保溫后酶活,計算相對酶活。(3)米氏常數(shù)測定:配制不同濃度的酪蛋白溶液(0、0.5、l.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、16.0、20.0g/L),在最適作用條件下,以不同濃度酪蛋白溶液為底物測定蛋白酶活性,采用雙倒數(shù)作圖確定Vm和Km。(4)底物選擇性:分別以酪蛋白(Casein)、大豆分離蛋白(SPI)和牛血清蛋白(BSA)為底物測定P1和P2的水解活性,分別設(shè)定兩種酶對Casein的水解活性為100%,計算其他底物的相對酶活。(5)酶解反應:pH7.2磷酸緩沖液配制5%SPI,85°C熱處理15min后,按酶與底物700U/g加入一定量酶液,置于45°C反應5h,反應后沸水浴滅活酶15min。(6)酶解產(chǎn)物分子量分布測定:高效液相色譜分析。色譜柱:TSKgel2000SWXL(300×7.8mm),流動相乙腈:水:三氟乙酸=45:55:0.1(體積比),紫外檢測波長220nm,流速0.5mL/min,柱溫30°C,進樣量10μL。2結(jié)果與分析2.1deea-puharaf蛋白表達純化2.1.1硫酸銨鹽析:米曲霉蛋白酶在硫酸銨飽和度為40%時開始析出,沉淀蛋白量和蛋白酶酶活力隨硫酸銨飽和度的增加而增加,當飽和度為80%時沉淀酶活力接近最高值。因此,采用40%飽和度除去少量雜蛋白,80%飽和度用于沉淀蛋白酶。采用Superdex-G200凝膠層析對DEAE-SepharoseFF衡洗階段的活性組分進行進一步純化(圖3A),活性峰與目的蛋白峰相吻合(命名為P1);采用Phenyl-SepharoseHP疏水層析和Superdex-G75凝膠層析對DEAE-SepharoseFF洗脫階段的活性組分進行進一步純化,Superdex-G75層析洗脫圖譜如圖3B所示,目的蛋白峰與雜質(zhì)蛋白峰分開,且與活性峰對應(命名為P2)。P1和P2的純化效果如表1和表2所示,P1經(jīng)純化后最終比活力達到2469.03U/mg,純化倍數(shù)為6.33,回收率為10.61%;P2經(jīng)純化后最終比活力達到1427.96U/mg,純化倍數(shù)為3.67,回收率為1.06%。2.2蛋白酶的電泳檢測將純化后的P1、P2進行SDS和酶譜分析(圖4),P1、P2在SDS圖中均顯示一條帶,說明兩種蛋白酶均已達到電泳純且都只由一條肽鏈構(gòu)成,分子量大小分別約為37kD和45kD。對照酶譜分析圖和SDS圖,兩種電泳方法得到的蛋白條帶位置不完全一致,可能是由于酶譜檢測前未對樣品進行變性處理,蛋白質(zhì)與SDS未能充分結(jié)合,導致蛋白質(zhì)所帶電荷偏低,使得其遷移速率低于SDS中,此外兩種電泳中蛋白質(zhì)形狀的差異,也會導致遷移速率不同。2.3p2p和pv穩(wěn)定性考察了pH、溫度對P1和P2活性、穩(wěn)定性的影響,P1的最適作用條件為pH8.0、45°C;P2的最適作用條件為pH7.0、45°C。在pH5-10范圍內(nèi),P1穩(wěn)定性良好,室溫放置60min相對酶活均在85%以上;在pH5.0-8.0范圍內(nèi),P2穩(wěn)定性良好,室溫放置60min相對酶活均保持在85%以上。P1和P2在40°C放置120min,相對酶活均在95%以上,說明在低于40°C條件下有較好的穩(wěn)定性;50°C放置120min,P1和P2會緩慢失活,其相對酶活分別為63%和47%;60°C放置30min,P1和P2活性幾乎完全喪失。2.4表觀普米氏計數(shù)以酪蛋白為底物,分別在不同底物濃度下測定兩種蛋白酶的活性。以底物濃度和產(chǎn)物(酪氨酸)生成量作圖,以1/S為橫坐標,1/V為縱坐標,得到兩種蛋白酶的雙倒數(shù)曲線如圖5所示,經(jīng)米氏方程計算,得到P1的表觀米氏常數(shù)Km=8.36g/L,Vm=12.95μg/(mL·min);P2的表觀米氏常數(shù)Km=4.11g/L,Vm=4.86μg/(mL·min)。2.5種底物蛋白以不同的蛋白為底物,考察了兩種蛋白酶對不同底物的水解活性(表3)。兩種蛋白酶對不同底物的作用效果有很大差異,在所選用的3種底物蛋白中,兩種蛋白酶對Casein的水解活性最高,其次為SPI,最差的是BSA。這可能與底物特性和蛋白酶的肽鍵選擇性有密切聯(lián)系,Casein是典型的疏水性蛋白,含有較高比例的Pro和Leu,而BSA是一種親水性蛋白,其肽鏈中疏水性氨基酸的比例相對較低。兩種蛋白酶均對Casein的水解活性最高而對BSA的水解活性較低,說明兩者對疏水氨基酸構(gòu)成的肽鍵有很強的切割能力。2.6大豆肽的降解由表4可知,SPI經(jīng)P1和P2分別酶解后,分子量大于10kD的多肽所占比例由83.86%分別降至9.51%和7.90%,表明兩種酶均能不同程度地降解SPI。據(jù)報道具有活性的大豆肽是以3-6個氨基酸組成的小分子肽為主,分子量在1kD以下。經(jīng)P1和P2酶解后,分子量小于1kD的小肽所占的比例顯著提高,P1酶解物中小于1kD的小肽占58.38%,P2酶解物中小于1kD的小肽占66.71%。3p2p和ps對蛋白底物氨基酸活性的肽鍵影響蛋白酶在食品上有廣泛的應用,研究不同蛋白酶的酶解特性對于蛋白水解物口感的提升和功能性小肽的研究具有重要意義。本文利用硫酸銨鹽析、DEAE-SepharoseFF陰離子交換層析、Phenyl-SepharoseHP疏水層析和Superdex-G75/200凝膠層析從米曲霉所產(chǎn)蛋白酶系中分離出兩種蛋白酶組分P1和P2,均已達到電泳純,分子量大小分別約為37kD和45kD,與湯鳴強等分離純化出的中性蛋白酶(73.4kD)和Vishwanatha等分離純化出的酸性蛋白酶均不同,推測兩種蛋白酶是新發(fā)現(xiàn)的蛋白酶,這將為米曲霉蛋白酶的進一步應用提供依據(jù)。P1和P2的酶學性質(zhì)研究表明,兩者的酶學性質(zhì)存在差異:P1的最適作用條件為pH8.0、45°C;P2的最適作用條件為pH7.0、45°C。P2的米氏常數(shù)較P1的要小,在一定程度上反映P2與底物具有較高的親和力。以Casein、SPI和BSA三種天然蛋白為底物時,P1和P2均對疏水性蛋白Casein有較高的水解活性,說明P1和P2對蛋白底物中的疏水性肽鍵具有很強的切割能力。一般來說,疏水性氨基酸在多肽中的含量越多苦味越強,另外Ishibashi等認為多肽呈現(xiàn)苦味需要兩個位點,其一為含較大疏水基團的氨基酸如Pro,另一為含疏水基團或較大堿性基團的氨基酸如Arg,當小肽中含有兩者形成的肽鍵時其苦味會加重,而本研究獲得的P1和P2對疏水性氨基酸構(gòu)成的肽鍵具有很強的選擇性,因此可在一定程度上降低多肽的苦味;但是,Otagiti研究表明疏水性氨基酸殘基位于C端時苦味比位于中間位置時要明顯,而P1和P2酶解后易形成C末端為疏水氨基酸的小肽,因此為提高兩種蛋白酶降低苦味的能力,可以考慮將P1和P2與端肽酶共同使用。功能性小肽的制備質(zhì)量及效果取決于所用的底物蛋白,也與蛋白酶的種類有關(guān)。本文獲得的蛋白酶P1和P2分別酶解大豆分離蛋白后,酶解產(chǎn)物中的組分分子量分布廣泛,這進一步說明P1和P2是內(nèi)肽酶,作用于蛋白肽鏈的內(nèi)部。P1和P2酶解產(chǎn)物中肽相對分子質(zhì)量分布呈現(xiàn)出一定的差異,這可能是由于兩種酶作用基團的不同造成的,它們作用于蛋白質(zhì)的不同位點,從蛋白質(zhì)內(nèi)部按照各自的酶切方式獲得酶解產(chǎn)物,