2024屆高三二輪復(fù)習(xí)生物：PCR技術(shù)1-重疊PCR技術(shù)

科普課：重疊PCR技術(shù)致敬：凱利·穆利斯凱利·穆利斯（KaryBanksMullis，1944年12月-2019年8月7日），美國(guó)著名化學(xué)家，因發(fā)明高效復(fù)制DNA片段的“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）”方法而獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。一.PCR技術(shù)PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，體系中加入dNTP、Mg2+以及延伸因子、擴(kuò)增增強(qiáng)因子，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。DNA聚合酶：

①具有5’→3’聚合酶活性，這就決定了DNA只能沿著5’→3’方向合成；

②需要引物，DNA聚合酶不能催化DNA新鏈從頭合成，只能催化dNTP加入核苷酸鏈的3'-OH末端。因而復(fù)制之初需要一段DNA引物的3’一OH端為起點(diǎn)，合成5’→3’方向的新鏈。DNA5’5’3’3’5’引物A5’引物B二.重疊PCR技術(shù)1.重疊PCR技術(shù)的定義重疊延伸PCR技術(shù)(genesplicingbyoverlapextensionPCR，SOEPCR)，是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)的技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)目前主要有兩個(gè)應(yīng)用方向：構(gòu)建融合基因；基因定點(diǎn)突變。引物A引物B設(shè)計(jì)：不同基因的引物互補(bǔ)序列二.重疊PCR技術(shù)2.重疊PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）構(gòu)建融合基因?qū)⒒騇和基因N鏈接起來(lái)的方法，我們可以用同尾酶切割，再用DNA鏈接酶將他們連在一起。但有時(shí)我們并不一定能夠找到合適的酶切位點(diǎn)，或者說(shuō)我們找到了酶切位點(diǎn)，但這種酶的特殊性（價(jià)格，保存），因此使用限制酶和DNA連接酶很難得到產(chǎn)物?；騇5’5’3’3’5’5’3’3’基因N二.重疊PCR技術(shù)2.重疊PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）構(gòu)建融合基因重疊PCR技術(shù)可以將基因M和基因N鏈接起來(lái)。其過(guò)程為：基因M5’5’3’3’5’5’3’3’基因N設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增兩端回收兩端片段兩端片段退火延伸擴(kuò)增全長(zhǎng)基因二.重疊PCR技術(shù)2.重疊PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）構(gòu)建融合基因基因M5’5’3’3’5’5’3’3’基因N引物B引物A引物C引物D①設(shè)計(jì)引物D’與引物D互補(bǔ)配對(duì)A’與引物A互補(bǔ)配對(duì)D’A’二.重疊PCR技術(shù)2.重疊PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）構(gòu)建融合基因基因M5’5’3’3’5’5’3’3’基因N引物B引物A引物C引物D②PCR擴(kuò)增兩端D’與引物D互補(bǔ)配對(duì)A’與引物A互補(bǔ)配對(duì)D’A’PCR只擴(kuò)增兩個(gè)引物之間的DNA片段，因此我們只分析其構(gòu)建的兩個(gè)引物（D’-A引物，A’-D引物）的與之結(jié)合的DNA鏈的復(fù)制。因?yàn)樵O(shè)計(jì)的這兩個(gè)因?yàn)閴A基互補(bǔ)配對(duì)，所以基因M,基因N要單獨(dú)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。二.重疊PCR技術(shù)2.重疊PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）構(gòu)建融合基因基因M5’5’3’3’5’5’3’3’基因N引物B引物A引物C引物D②PCR擴(kuò)增兩端D’與引物D互補(bǔ)配對(duì)A’與引物A互補(bǔ)配對(duì)D’A’5’3’AD’5’3’DA’PCR擴(kuò)增第一次二.重疊PCR技術(shù)2.重疊PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）構(gòu)建融合基因②PCR擴(kuò)增兩端D’與引物D互補(bǔ)配對(duì)A’與引物A互補(bǔ)配對(duì)5’3’AD’5’3’DA’PCR擴(kuò)增第二次5’3’AD’5’3’DA’5’3’5’3’5’3’引物BA’D5’3’引物C二.重疊PCR技術(shù)2.重疊PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）構(gòu)建融合基因③回收兩端片段

并進(jìn)行④兩端片段退火延伸5’3’AD’5’3’DA’5’3’引物BA’D5’3’引物C為了方便理解，我們把這4條鏈編上序號(hào)：1、2、3、4，退火后的結(jié)果為：AD’15’3’12345’3’4DA’AD’引物CAD’35’3’5’引物BA’2D3’基因M和基因N重疊區(qū)域二.重疊PCR技術(shù)2.重疊PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）構(gòu)建融合基因⑤擴(kuò)增全長(zhǎng)基因DA’AD’15’3’5’3’4引物CAD’35’3’5’引物BA’2D3’DNA聚合酶：具有5’→3’聚合酶活性，這就決定了DNA只能沿著5’→3’方向合成；（

）（

）√×二.重疊PCR技術(shù)2.重疊PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）構(gòu)建融合基因⑤擴(kuò)增全長(zhǎng)基因3引物CAD’5’3’5’引物BA’2D3’DNA聚合酶：具有5’→3’聚合酶活性，這就決定了DNA只能沿著5’→3’方向合成；（

）√DNA聚合酶會(huì)結(jié)合在該DAN分子上，繼續(xù)完成該DNA的合成，進(jìn)而將基因M,基因N鏈接在一起DNA聚合酶DNA聚合酶二.重疊PCR技術(shù)2.重疊PCR技術(shù)的應(yīng)用（2）定點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)四種引物，用第一對(duì)引物（a、b）擴(kuò)增含有突變位點(diǎn)及其上游序列的DNA片段，第二對(duì)引物（c、d）被用來(lái)擴(kuò)增含突變位點(diǎn)及其下游序列的DNA片段，兩個(gè)側(cè)翼引物（a、d）含野生型序列，兩個(gè)突變引物（b、c）含有希望引進(jìn)的突變位點(diǎn)，如置換、插入或缺失的堿基（紅點(diǎn)）?；旌蟽纱蜳CR的產(chǎn)物，由于兩個(gè)突變引物有重疊區(qū)，重疊片段之間退火、延伸成異源雙鏈，加入外側(cè)引物進(jìn)行第三次PCR，即可得到目標(biāo)突變體。突變引物b和突變引物c堿基互補(bǔ)配對(duì)并含有用于替換、插入或缺失的堿基5’5’3’3’上游引物a下游引物d突變引物c突變引物b(獨(dú)立體系1)PCRcadb(獨(dú)立體系2)PCR5’3’5’3’重疊、延伸a5’3’d5’3’3’5’3’5’PCR二.重疊PCR技術(shù)例1.（北京?海淀?期中）蘿卜的蛋白A具有廣泛的抗植物病菌作用，而且對(duì)人體沒(méi)有影響。我國(guó)科學(xué)家欲獲得高效表達(dá)蛋白A的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌作為微生物農(nóng)藥，做了相關(guān)研究。（1）研究者用相同的

酶處理蛋白A基因和pET質(zhì)粒，得到了重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒置于經(jīng)

處理的大腸桿菌細(xì)胞懸浮液中，獲得轉(zhuǎn)基因大腸桿菌。（2）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入的蛋白A基因在大腸桿菌中表達(dá)效率很低，研究者推測(cè)不同生物對(duì)密碼子具有不同的偏好。因而設(shè)計(jì)了與蛋白A基因結(jié)合的兩對(duì)引物（引物B和C中都替換了一個(gè)堿基），并按圖2方式依次進(jìn)行4次PCR擴(kuò)增，以獲得新的蛋白A基因。限制酶和DNA鏈接酶氯化鈣引物A引物B引物C引物DPCR1PCR2PCR3PCR4二.重疊PCR技術(shù)①這是一種定點(diǎn)

技術(shù)。②圖2所示的4次PCR應(yīng)該分別如何選擇圖1中所示的引物？請(qǐng)?zhí)顚懸韵卤砀瘢ㄈ暨x用該引物劃“√”，若選用該引物劃“×”）基因突變√√××××√√××××√××√二.重疊PCR技術(shù)（3）研究者進(jìn)一步將含有新蛋白A基因的重組質(zhì)粒和

分別導(dǎo)入大腸桿菌，提取培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)，用

方法檢測(cè)并比較三組受體菌蛋白A的表達(dá)產(chǎn)物，判斷蛋白A基因表達(dá)效率是否提高。為檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的生物活性。研究者將上述各組表達(dá)產(chǎn)物加入到長(zhǎng)滿了植物病菌的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時(shí)間后，比較

大小，以確定表達(dá)產(chǎn)物的生物活性大小。（4）作為微生物農(nóng)藥，使用時(shí)常噴灑蛋白A基因的發(fā)酵產(chǎn)物而不是轉(zhuǎn)蛋白A基因的大腸桿菌，其優(yōu)點(diǎn)是

。含有蛋白A基因的重組質(zhì)?？召|(zhì)粒（pET質(zhì)粒）、抗原