土壤微生物的研究進(jìn)展

土壤微生物的研究進(jìn)展

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在養(yǎng)分循環(huán)和能量流動(dòng)中起著重要作用（schroter等人，2003）。土壤微生物對(duì)外界條件的變化反應(yīng)敏感,微生物群落結(jié)構(gòu)可以指示土壤肥力的變化(Steenwerthetal.,2002;White&Rice,2009)。作為一項(xiàng)土壤質(zhì)量指標(biāo),土壤微生物在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的研究中具有重要的意義。種植方式的改變會(huì)引起土壤肥力的變化。在不同的種植方式下,由于植物種類(lèi)和人類(lèi)活動(dòng)強(qiáng)弱的差異,土壤的物理、化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化(Calderónetal.,2000)。研究發(fā)現(xiàn),黑土由草地向農(nóng)田進(jìn)而向裸地的演變過(guò)程中,土壤微生物群落的功能多樣性呈下降趨勢(shì),植被類(lèi)型可能是土壤微生物多樣性變化的重要推動(dòng)力之一(孟慶杰等,2008)。耕作能使土壤結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,降低底物的豐度和均勻度,影響土壤微生物的代謝,降低土壤微生物的多樣性(Lupwayietal.2001)。土壤微生物是土壤質(zhì)量變化的早期預(yù)警指標(biāo),可以為預(yù)測(cè)不同種植方式下土壤肥力的變化趨勢(shì)提供可靠的依據(jù)(Zellesetal.,1992)。磷脂脂肪酸是磷脂的構(gòu)成成分,它具有結(jié)構(gòu)多樣性和生物特異性。土壤中磷脂脂肪酸的存在及其豐度可揭示特定生物或生物種群的存在及其豐度。磷脂脂肪酸在細(xì)胞死亡后快速降解,故可用來(lái)表征微生物群落中“存活”的那部分群體(Zelles,1999)。磷脂脂肪酸分析方法是一種快速、可靠的分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的方法,通過(guò)對(duì)磷脂脂肪酸的定量測(cè)定,可了解微生物活細(xì)胞生物量和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)(Bossioetal.,1998)。用磷脂脂肪酸方法檢測(cè)環(huán)境樣品中微生物群落,可避免由培養(yǎng)和直接的計(jì)數(shù)方法引起的問(wèn)題,與傳統(tǒng)方法相比,它能更精確地測(cè)定微生物的生物量(Green&Scow,2000)。東北三省擁有我國(guó)唯一一條玉米帶,與同緯度的美國(guó)玉米帶、烏克蘭玉米帶并稱(chēng)為世界“三大黃金玉米帶”。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明,2009年?yáng)|北玉米種植面積占全國(guó)玉米種植面積的28%,玉米產(chǎn)量占全國(guó)玉米總產(chǎn)量的30%左右(中華人民共和國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局,2009)。隨著東北地區(qū)玉米播種面積的逐年增加傳統(tǒng)的輪作換茬已經(jīng)被連作所代替。隨著玉米連作年限的增長(zhǎng),東北玉米帶土壤肥力退化的問(wèn)題日益突出(趙蘭坡等,2006)。本研究在長(zhǎng)期定位試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用磷脂脂肪酸方法,深入研究了3種種植方式(玉米連作、玉米非連作和撂荒)對(duì)土壤微生物群落組成的影響,以期為東北地區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展及建立合理的農(nóng)業(yè)種植方式提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1玉米玉米試驗(yàn)地點(diǎn)選在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)長(zhǎng)期定位試驗(yàn)田(43°48′N(xiāo),125°23′E),海拔為210.7m,年平均氣溫為4.8℃,年平均降水量為615mm。土壤類(lèi)型為草甸黑土。1984年在試驗(yàn)地進(jìn)行勻地播種,1985–1994年為玉米(Zeamays)和大豆(Glycinemax)等作物輪作,1994年至今連種玉米。本研究選取不同種植方式如下:玉米連作不施肥(連作)、玉米非連作(當(dāng)季作物為豆科,非連作)和撂荒(作為對(duì)照),重復(fù)3次。其土壤基本理化性質(zhì)見(jiàn)表1。1.2土樣的采集混合土樣2009年8月3日用土鉆在每個(gè)小區(qū)采集10鉆表層土壤(0–20cm),混合為1個(gè)土樣。樣品除去動(dòng)植物殘?bào)w等雜質(zhì),用四分法(魯如坤,2000)去除多余的土樣,裝入密封袋,立即置于冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,過(guò)2mm篩,放于4℃冰箱中保存,并盡快進(jìn)行微生物群落特征分析。1.3土壤ph、磷、有機(jī)質(zhì)測(cè)定土壤總碳和總氮測(cè)定采用元素分析儀(VarioELIII,ElementarAnalysensystemeGmbH,Hanau,Germany)。土壤pH測(cè)定的水土比為2.5:1。土壤有效磷測(cè)定采用Olsen法(Olsenetal.,1954)。土壤有機(jī)質(zhì)測(cè)定采用水合熱重鉻酸鉀氧化-比色法;土壤堿解氮測(cè)定采用堿解擴(kuò)散法;土壤硝態(tài)氮測(cè)定采用紫外分光比色法;銨態(tài)氮測(cè)定采用靛藍(lán)比色法(魯如坤,2000)。土壤>0.25mm水穩(wěn)性團(tuán)聚體含量測(cè)定采用濕篩法(GB7846-87)。1.4脂肪酸的識(shí)別與定量參照土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的測(cè)定采用磷脂脂肪酸法。土壤微生物磷脂脂肪酸提取參照修正的Bligh-Dyer方法(Bligh&Dyer,1959),正十九烷脂肪酸甲酯(nonadecanoicacidmethylester)為內(nèi)標(biāo),用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(6890GC-5973MSAgilent,AgilentTechnologies,SantaClara,USA)測(cè)定,檢測(cè)中使用的升溫程序如下:進(jìn)樣后在50℃保持1min,之后以12℃·min–1的速率升到180℃,保持2min后,以6℃·min–1的速率上升到220℃,停留2min后以15℃·min–1的速率上升到240℃,保持1min后以15℃·min–1的速率達(dá)到最終溫度260℃,保持15min。氣相色譜與質(zhì)譜之間溫度為280℃,用高純氦氣(1mL·min–1)做載氣。質(zhì)譜儀采用電子電離(EI)方式,電子能量為70eV。各脂肪酸的識(shí)別與定量參照細(xì)菌脂肪酸甲酯混標(biāo)(BacterialAcidMethylEsters)和37種脂肪酸甲酯混標(biāo)(Supelcoe37ComponentFAMEMix)。磷脂脂肪酸分子式格式一般為(i/a)X:YωZ(c/t),其中X代表碳原子的數(shù)目,Y代表分子中雙鍵的數(shù)目,Z指第一個(gè)雙鍵距磷脂脂肪酸分子甲基(ω)的位置。前綴“i”或“a”代表距第二、第三碳原子上的支鏈,后綴“c”或“t”指分子的順?lè)唇Y(jié)構(gòu)?！癱y”代表分子中具有環(huán)丙基結(jié)構(gòu)。磷脂脂肪酸18:2ω6,9指示真菌群落生物量;磷脂脂肪酸14:0、15:0、i15:0、a15:0、16:0、i17:0、a17:0、17:0、cy17:0、16:1ω7t、i19:0、cy19:0指示細(xì)菌脂肪酸(Frosteg?rd&B??th,1996;Zelles,1999);同時(shí)用飽和脂肪酸(normalsaturatedfattyacids,NSAT)14:0、15:0、16:0、17:0、18:0之和輔助指示細(xì)菌生物量;革蘭氏陽(yáng)性菌用支鏈脂肪酸(terminallybranchedsaturatedfattyacids,TBSAT)i15:0、a15:0、i16:0、i17:0表示;革蘭氏陰性菌用單烯不飽和脂肪酸(monounsaturatedfattyacids,MONO)16:1ω7t、18:1ω8c、18:1ω9c或環(huán)化脂肪酸(cyclopropylfattyacids,CYCLO)cy17:0、cy19:0表示;微生物群落總量以各磷脂脂肪酸加和表示(Zellesetal.,1992;B?ehmeetal.,2005)。1.5微生物群落結(jié)構(gòu)分析應(yīng)用SPSS16.0處理數(shù)據(jù),采用單因素方差分析檢驗(yàn)不同處理之間的差異,同時(shí)應(yīng)用此軟件對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)做主成分分析(principlecomponentanalysis,PCA)。應(yīng)用CANOCO4.5進(jìn)行冗余分析(redundancyanalysis,RDA)。作圖在SigmaPlot10.0軟件中進(jìn)行。2環(huán)境因子對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響在不同的種植方式下,總磷脂脂肪酸、細(xì)菌磷脂脂肪酸、真菌磷脂脂肪酸和真菌/細(xì)菌發(fā)生變化。其中,總磷脂脂肪酸和細(xì)菌磷脂脂肪酸變化趨勢(shì)相似(表2):撂荒土壤總磷脂脂肪酸和細(xì)菌磷脂脂肪酸分別為42.98和24.68nmol·g–1,分別高于連作和非連作;連作土壤微生物總磷脂脂肪酸和細(xì)菌磷脂脂肪酸最低,分別為33.12和18.09nmol·g–1。非連作土壤真菌磷脂脂肪酸和真菌/細(xì)菌分別為0.61nmol·g–1和3.06%,顯著低于撂荒和連作(p<0.05)。飽和脂肪酸(NSAT)可代表總細(xì)菌生物量;支鏈脂肪酸(TBSAT)在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中所占比例較高,可指示革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的生物量;單烯不飽和脂肪酸(MONO)和環(huán)化脂肪酸(CYCLO)常見(jiàn)于革蘭氏陰性細(xì)菌;TBSAT/MONO和TBSAT/CYCLO比值可指示革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌/革蘭氏陰性細(xì)菌,MONO/NSAT可以指示土壤環(huán)境條件的變化。如圖1所示,撂荒處理的細(xì)菌群落的指標(biāo)都達(dá)到最大,連作處理的細(xì)菌生物量指標(biāo)的NSAT和指示革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的TBSAT含量最低,非連作處理的指示革蘭氏陰性細(xì)菌的MONO和CYCLO含量最低。TBSAT/MONO和TBSAT/CYCLO變化規(guī)律相似:非連作>連作>撂荒。MONO/NSAT在撂荒處理中最高,而在非連作處理中最低。主成分分析是處理數(shù)學(xué)降維的一種方法,將多個(gè)變量通過(guò)線(xiàn)性變換以選出較少個(gè)數(shù)重要變量。主成分個(gè)數(shù)的提取原則是主成分對(duì)應(yīng)的特征值大于1的前m個(gè)主成分。根據(jù)此原則,共提取出了6個(gè)主成分,累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)98.25%。其中,第一主成分(PC1)貢獻(xiàn)率是31.16%,第二主成分(PC2)貢獻(xiàn)率是22.80%。第三至第六主成分貢獻(xiàn)率分別是16.48%、13.08%、10.21%、5.65%,因貢獻(xiàn)率太小,所以本文只解釋第一主成分和第二主成分(圖2A)。對(duì)26種磷脂脂肪酸進(jìn)行主成分分析發(fā)現(xiàn),不同種植方式土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在第一主成分上出現(xiàn)明顯的分布差異:連作和非連作土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相似,分布于第一主成分負(fù)方向上,而撂荒分布于第一主成分正方向上。進(jìn)一步對(duì)主成分得分系數(shù)進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn),撂荒處理的第一主成分得分系數(shù)與連作和非連作差異顯著(p<0.05),而各處理的第二主成分得分系數(shù)差異不顯著(表3)。單個(gè)磷脂脂肪酸初始載荷因子主成分分析結(jié)果表明,對(duì)第一主成分起主要作用的磷脂脂肪酸是15:0、16:1ω7t、cy17:0、18:2ω6,9;對(duì)第二主成分起主要作用的磷脂脂肪酸是cy19:0、18:1ω7t、10Me19:0、10Me18:0(圖2B)。主成分分析揭示了不同處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的區(qū)別,冗余分析(redundancyanalysis,RDA)則可進(jìn)一步確定樣地中環(huán)境因子對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響(McKinleyetal.,2005)。選取有機(jī)質(zhì)(SOM)、總碳(TC)、總氮(TN)、硝態(tài)氮(NO3–-N)、銨態(tài)氮(NH4+-N)、堿解氮(AN)、有效磷(AP)、pH和土壤>0.25mm水穩(wěn)性團(tuán)聚體含量(SWSA)作為環(huán)境因子。箭頭越長(zhǎng)表示該環(huán)境因子對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響越大;箭頭所成的夾角越小表示相關(guān)性越大。由圖3可以看出,pH、TN、有效磷和土壤>0.25mm水穩(wěn)性團(tuán)聚體的含量與大部分磷脂脂肪酸箭頭指向一致,說(shuō)明它們之間呈正相關(guān)。根據(jù)箭頭的長(zhǎng)度得出,pH和土壤>0.25mm水穩(wěn)性團(tuán)聚體對(duì)土壤微生物群落的影響最大。3對(duì)土壤微生物的影響目前磷脂脂肪酸分析方法被廣泛地應(yīng)用于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究。磷脂脂肪酸存在于活體微生物的細(xì)胞膜上,作為生物標(biāo)記物可以揭示微生物的種群,具有較高的準(zhǔn)確性和敏感性(Kauretal.,2005)。大量的研究表明,土壤耕作和植物種類(lèi)等是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素(Nusslein&Tiedje,1999;Calderónetal.,2000)。不同種植方式對(duì)土壤微生物產(chǎn)生較大影響,土壤微生物群落變化明顯(Cooksonaetal.,2008)。耕作土壤的總磷脂脂肪酸和細(xì)菌磷脂脂肪酸小于撂荒處理,較少的農(nóng)業(yè)措施干預(yù),可以保持土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的豐富度和均勻度,而長(zhǎng)期高強(qiáng)度的農(nóng)業(yè)耕作措施可能會(huì)抑制黑土細(xì)菌群落的生長(zhǎng)(白震等,2008)。土壤團(tuán)聚體是微生物生存的重要場(chǎng)所,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)大團(tuán)聚體中的微生物生物量比微團(tuán)聚體中的高(Franzluebbers&Arshad,1997),耕作改變了土壤團(tuán)聚體的特征,長(zhǎng)期的傳統(tǒng)耕作破壞了表層土壤團(tuán)聚體,耕作后土壤團(tuán)聚體的數(shù)量和直徑小于未耕作的土壤(Bünemannetal.,2004),而休閑耕作可以顯著地增加土壤團(tuán)聚體的數(shù)量和大小(Franzluebbers&Arshad,1996)。本研究中,撂荒增加了土壤>0.25mm水穩(wěn)性團(tuán)聚體的含量,改善了土壤結(jié)構(gòu),有利于微生物生長(zhǎng)。不同種植方式改變了覆蓋土壤的植物種類(lèi),植物通過(guò)影響土壤環(huán)境,進(jìn)而影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)(Nusslein&Tiedje,1999)。非連作種植豆科作物有利于固氮菌等細(xì)菌群落的生長(zhǎng),土壤真菌/細(xì)菌下降。個(gè)別磷脂脂肪酸載荷因子的結(jié)果表明,真菌和部分細(xì)菌受種植方式影響明顯。TBSAT被認(rèn)為是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的重要生物標(biāo)記物,MONO和CYCLO是革蘭氏陰性細(xì)菌的有效標(biāo)識(shí)物(Frosteg?rd,etal.,1993)。TBSAT/MONO和TBSAT/CYCLO的變化規(guī)律相似,都可表示革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌/革蘭氏陰性細(xì)菌。撂荒處理的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌/革蘭氏陰性細(xì)菌低于連作和非連作處理研究表明節(jié)桿菌(Arthrobacter)等革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌對(duì)環(huán)境脅迫如饑餓的適應(yīng)能力強(qiáng)于假單胞菌(Pseudomonas)等革蘭氏陰性細(xì)菌(Kieftetal.,1994),撂荒改善土壤條件,有利于革蘭氏陰性細(xì)菌的積累。MONO/NSAT可評(píng)估微生物群落與環(huán)境條件。B?hme等(2005)研究德國(guó)兩個(gè)長(zhǎng)期施肥試驗(yàn)點(diǎn)砂壤土和壤土土壤微生物特征的變化,試驗(yàn)土壤輪作甜菜(Betavulgaris)、春大麥(Hordeumvulgare)、土豆(Solanumtuberosum)和冬小麥(Triticumaestivum),3月份采樣,研究表明農(nóng)田土壤施肥及對(duì)照MONONSAT的比值一般大于1,而本研究中各處理的MONO/NSAT小于1,可能與土壤類(lèi)型、采樣時(shí)間及種植作物類(lèi)型等因素有關(guān)。冗余分析(RDA)可以合理地解釋環(huán)境因子對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響(Kennedyetal.,2004)。本研究得出,pH、TN、有效磷、土壤>0.25mm水穩(wěn)性團(tuán)聚體含量與大部分磷脂脂肪酸之間呈正相關(guān)關(guān)系。土壤pH、TN、有效磷是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因素,因?yàn)橥寥牢⑸锏纳L(zhǎng)狀況取決于土壤肥力和營(yíng)養(yǎng)元素供給(Zelles,1999)。磷脂脂肪酸法是目前測(cè)定微生物群落結(jié)構(gòu)的常用方法。該方法可直接檢測(cè)微生物群落,避免培養(yǎng)和計(jì)數(shù)方法引起的問(wèn)題,實(shí)驗(yàn)條件要求低,相對(duì)容易快速處理大量樣品,可以全面精確地反映土壤微生物的群落信息。當(dāng)然,磷脂脂肪酸方法也存在一些問(wèn)題:磷脂脂肪酸方法不能在種屬和株系水平鑒定微生物的種類(lèi);尚未確立土壤中所有微生物特征脂肪酸;不能鑒定古菌。因此,可以結(jié)合其他研究微生物多樣性的方法更加全面地認(rèn)識(shí)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。本研究中得到的磷脂脂肪酸的結(jié)果與采用Biolog方法測(cè)定的結(jié)果一致(時(shí)鵬等,2010