一代-二代-三代測序原理

一代測序一代測序一般指Sanger測序，是上世紀(jì)70年代由sanger和Coulson開創(chuàng)的DNA雙脫氧鏈終止法測序，當(dāng)初幾十個國家花了幾十億刀完成的人類基因組計劃就是使用的改良版sanger測序。Sanger測序一次可以讀取600-1000bp的堿基，準(zhǔn)確性十分之高，至今仍是正確性的金標(biāo)準(zhǔn)。該技術(shù)在當(dāng)下依然被廣泛應(yīng)用，比如構(gòu)建載體做克隆，基因敲除等實驗都可以用到。但其通量實在太低，導(dǎo)致在很多情況下成本太高，難以廣泛應(yīng)用。一代、二代、三代測序都是利用DNA聚合酶原理，DNA聚合酶催化下一個脫氧核糖核苷酸5’的磷酸和上一個脫氧核糖核苷酸3’羥基形成磷酸二酯鍵，如果某個脫氧核糖核苷酸3’羥基被脫氧或者被疊氮鈉修飾，則終止反應(yīng)。缺少3'位的羥基的ddNTP結(jié)合到DNA鏈上，會使得后面的單脫氧核苷酸（dNTP）無法再聚合上來，致使聚合反應(yīng)終止。二代測序技術(shù)，又稱為NextGenerationSequencing（NGS）技術(shù)，高通量測序技術(shù)，是為了改進一代測序通量過低的問題而出現(xiàn)的。剛面世時主要包括Roche公司的454技術(shù)、ABI公司的Solid技術(shù)和Illumina公司的Solexa技術(shù)。這三種技術(shù)都極大的提高了測序的通量，大大降低了測序成本和周期。其中Illumina公司憑借超低的測序成本和可以接受的讀長，成為了目前最主流的二代測序公司，其測序成本近五年來從幾千元1G（1G即10億堿基）降到了到今天的40多塊錢?；瘜W(xué)試劑三羧基乙基膦（TCEP）淬滅熒光信號；有時熒光基團切割不完全給簇形成熒光背景，導(dǎo)致測序夠長。疊氮保護基團遇到巰基試劑(如二巰基丙醇)會發(fā)生斷裂，并在原來的位置形成羥基，供下一個堿基合上。二代測序文庫的構(gòu)建a類微生物等的基因組DNA：采用酶或者超聲波將基因組打斷，然后用DNA聚合酶補平，并在3‘加一個A堿基；b類人等超大片段基因組：采用轉(zhuǎn)座酶，Tn5本身是一個DNA轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶，它可以帶著自己的DNA在基因組上到處插入，研究人員就借用了Tn5的這個特點將其用于文庫構(gòu)建。2.RT-PCRc類基因組RNA：采用酶或者超聲波將基因組打斷，然后隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄pcr，然后DNA聚合酶在cDNA的3‘加一個A堿基二代測序文庫的構(gòu)建Rd1SP：第一條鏈測序引物；I7：第一條測序完，用I7引物測序第一條鏈上的index1序列；P5：再用P5為引物測序第一條鏈上的index2；Rd1SP：第二條鏈測序引物；因不同的樣品可以同時在一個流動槽里進行測序反應(yīng)，index1和index2序列可以通過加或者不加來區(qū)分不同的樣本來源；二代測序和一代測序最大的不同點在于其邊合成邊測序技術(shù)。二代測序二代測序測序流動槽(flowcell)：每個槽都有共價交聯(lián)的兩種oligo（P5和P7），分別與文庫兩端的接頭互補。DNA聚合酶NaOH解開雙鏈后模板鏈被洗掉橋式PCR合成另一條鏈NaOH解開雙鏈P7P5二代測序二代測序化學(xué)方法切斷P5與流動槽共價連接的單鏈被切斷后洗掉流動槽加入引物Rd1SP、DNA聚合酶、熒光標(biāo)記的dNTP，對第一條鏈測序一輪反應(yīng)只能加上一個堿基，一個簇只能測150-300個反應(yīng)。洗掉雜質(zhì)后加入引物I7，DNA聚合酶，熒光標(biāo)記的dNTP，對index1進行測序洗掉雜質(zhì)后，DNA聚合酶，熒光標(biāo)記的dNTP，對index2進行測序，并合成另一條鏈P7與流動槽共價連接的單鏈被切斷后洗掉流動槽加入引物Rd2SP、DNA聚合酶、熒光標(biāo)記的dNTP，對第二條鏈測序。合成一個堿基就用激光掃描一次，每一個簇上都形成相應(yīng)的信號，然后再合成一個堿基再掃描。二代測序技術(shù)雖然通量很高，成本低廉，但是讀長實在太短，主流的Illumina測序儀，常規(guī)模式一個簇的一個反應(yīng)只能測150-300bp的長度，如果測雙鏈則是300-600bp，靠著軟件算法上的進步才得以可用。測得長才是王道??！由此三代測序走上了歷史舞臺。二代測序三代測序主要有兩種技術(shù)：PacBio公司的SMRT和OxfordNanoporeTechnologies的納米孔單分子測序技術(shù)，這兩種技術(shù)的測序讀長都可以達到幾十kb的級別，遠遠高于二代測序技術(shù)。SMRTSequencingTechnology單分子實時測序技術(shù)（SingleMolecular，RealTime）原理：邊合成邊測序的原則，一個納米孔的底部共價結(jié)合一個生物素分子，通過鏈霉親和素，將偶聯(lián)生物素的DNA聚合酶錨定到納米孔的底部，4種熒光標(biāo)記的dNTP在堿基配對階段發(fā)出不同光，根據(jù)光波長和峰值可判斷進入堿基的類型，磷酸二酯鍵形成過程熒光基團被切掉。讀長跟DNA聚合酶活性保持有關(guān)，長時間激光照射下可能蛋白變性。三代測序三代測序SMRTCell含有納米級的零模波導(dǎo)孔，每個ZMW都能夠包含一個DNA聚合酶及一條DNA樣品鏈進行單分子測序，并實時檢測插入堿基的熒光信號。ZMW是一個直徑只有10~50nm的孔，當(dāng)激光打在ZMW底部時，只能照亮很小的區(qū)域，DNA聚合酶就被固定在這個區(qū)域。只有在這個區(qū)域內(nèi)，堿基攜帶的熒光基團被激活從而被檢測到，大幅地降低了背景熒光干擾。三代測序1GB=10億pb三代測序三代測序二代測序dNTP熒光標(biāo)記在堿基上三代測序dNTP熒光標(biāo)記在5‘磷酸基團上三代測序四色熒光基團標(biāo)記的dNTP加入ZMW孔中；與模板序列對應(yīng)的dNTP進行配對，進入ZMW孔底物檢測區(qū)域，激發(fā)光照射下發(fā)射對應(yīng)的熒光，經(jīng)過光學(xué)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的堿基識別信號；磷酸二酯鍵合成后，磷酸基團脫落，熒光基團隨著脫落；重復(fù)①-③注：經(jīng)過改良的DNA聚合酶每秒合成3個堿基，確保光學(xué)系統(tǒng)能夠捕捉到相應(yīng)堿性釋放的熒光信號。而正常的DNA聚合酶在天然狀態(tài)下每秒合成100多個堿基，有的甚至達到1000多堿基。三代測序三代測序SMRT測序優(yōu)勢優(yōu)勢1：超長讀長優(yōu)勢2：無GC偏好性二代測序讀長短，靠發(fā)軟件算法才能拼接，如果遇到大基因組測序，有時無法在合理時間內(nèi)完成拼接。三代測序讀長長，遇到大基因組測序，在極短時間內(nèi)完可成拼接。有報道稱山羊全基因組測序三代測序比二代速度快了5倍。測序不受GC含量的影響，因為構(gòu)建文庫過程無需PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)GC含量高的片段比GC含量低的片段擴增慢，所以二代測序GC含量高的片段出現(xiàn)概率要低。三代測序SMRT測序優(yōu)勢優(yōu)勢3：高準(zhǔn)確率單堿基的錯誤是由實時激光掃描的識別能力造成的。堿基合成速度太快會導(dǎo)致測序結(jié)