微量元素對(duì)吉富羅非魚生長(zhǎng)、代謝和非特異性腎功能的影響

微量元素對(duì)吉富羅非魚生長(zhǎng)、代謝和非特異性腎功能的影響

養(yǎng)分是維持動(dòng)物生活和生產(chǎn)所必需的養(yǎng)分之一。雖然動(dòng)物飼料中的含量較低，但它們直接或間接地參與身體的大多數(shù)生理和生化過(guò)程，與動(dòng)物的生長(zhǎng)和健康密切相關(guān)。微量元素缺乏或過(guò)量都會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物生物化學(xué)的、結(jié)構(gòu)的和功能性的病理學(xué)變化。當(dāng)今對(duì)微量元素的認(rèn)識(shí),無(wú)論是從動(dòng)物種類上、微量元素形式上,還是微量元素供給量以及比例上都有巨大的變革和突破,它對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)、繁殖、免疫、抗病、體形、體色以及肉質(zhì)等都會(huì)產(chǎn)生較大的影響。影響微量元素生物利用率的因素很多,如動(dòng)物機(jī)體的生理狀態(tài)、微量元素的化學(xué)形式和數(shù)量以及飼料中存在的一些抗?fàn)I養(yǎng)因子。動(dòng)物對(duì)微量元素利用的高低還取決于其吸收狀況,而微量元素的形式是影響其吸收和利用的主要因素之一。通常,水產(chǎn)飼料中都是以無(wú)機(jī)鹽形式補(bǔ)充微量元素。無(wú)機(jī)鹽形式的微量元素存在著難吸收、生物利用率低、生化功能差和對(duì)環(huán)境污染大的缺點(diǎn)。氨基酸微量元素具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、分子量低、易吸收、生物學(xué)效價(jià)高等特點(diǎn),已引起動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家和飼料生產(chǎn)者的高度關(guān)注,并已廣泛地應(yīng)用到畜禽飼料工業(yè)中,而在水產(chǎn)飼料中相關(guān)的研究報(bào)道較少,少量的報(bào)道也僅局限在單一的氨基酸微量元素上,有關(guān)復(fù)合氨基酸微量元素的研究則未見報(bào)道。為此,本試驗(yàn)以吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)為試驗(yàn)對(duì)象,在實(shí)用飼料配方的基礎(chǔ)上,探討氨基酸微量元素對(duì)羅非魚生長(zhǎng)、代謝和非特異性免疫力的影響,以期為氨基酸微量元素在水產(chǎn)飼料中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1氨基酸微量元素衍生物微量元素鐵(Fe)、鋅(Zn)、錳(Mn)、銅(Cu)分別以無(wú)機(jī)微量元素、氨基酸微量元素和氨基酸微量元素組合體形式添加到吉富羅非魚實(shí)用飼料(粗蛋白質(zhì)32%,總能14MJ/kg)中,組成3種試驗(yàn)飼料,其中無(wú)機(jī)微量元素為FeSO4·H2O、ZnSO4·H2O、MnSO4·H2O、CuSO4·5H2O,均為飼料級(jí),由成都蜀星飼料有限公司提供;氨基酸微量元素為氨基酸螯合鐵[Fe15%(15.42%),氨基酸(AA)30%]、氨基酸螯合鋅[Zn15%(15.46%),AA30%]、氨基酸螯合錳[Mn10%(10.11%),AA20%]、氨基酸螯合銅[Cu15%(15.35%),AA30%],由施普諾生物技術(shù)(成都)有限公司提供,括號(hào)內(nèi)為實(shí)測(cè)值;氨基酸微量元素組合體為氨基酸與Fe、Zn、Mn、Cu螯合的組合體,即按比例稱取微量元素混勻后,與氨基酸進(jìn)行螯合反應(yīng)配制而成,其中Fe8.98%、Zn4.18%、Mn1.46%、Cu0.24%,均為實(shí)測(cè)值,由施普諾生物技術(shù)(成都)有限公司提供。試驗(yàn)飼料1(無(wú)機(jī)組)中微量元素Fe、Zn、Mn、Cu的添加量分別為160、80、28、4mg/kg,試驗(yàn)飼料2(有機(jī)組)和3(有機(jī)組合體組)中Fe、Zn、Mn、Cu添加量均為試驗(yàn)飼料1添加量的50%,即分別為80、40、14、2mg/kg。3種試驗(yàn)飼料中Fe、Zn、Mn、Cu保持相同的比例,即均為40∶20∶7∶1。此外,以不添加微量元素Fe、Zn、Mn、Cu的試驗(yàn)飼料為對(duì)照飼料。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。飼料原料均為符合國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的飼料級(jí)原料,飼料原料均粉碎過(guò)40目篩,飼料調(diào)質(zhì)溫度為80℃,分別制成直徑為2.5mm的硬顆粒飼料,60℃烘干后保存于-15℃冰柜中備用。1.2實(shí)行專四飼養(yǎng),聯(lián)合飼養(yǎng)試驗(yàn)魚選用當(dāng)年培育的全雄性吉富羅非魚魚苗,取自重慶璧山縣魚種場(chǎng)。馴食適應(yīng)環(huán)境10d后,選取體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊、平均體重為(27.2±0.1)g的吉富羅非魚360尾,隨機(jī)分成4組,每組設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)30尾魚,以重復(fù)為單位飼養(yǎng)在室內(nèi)淡水循環(huán)玻璃水族箱(有效體積為250L)中。日投喂率為體重的4%~6%,每天08:30、12:30和17:30各投喂1次,每2周稱重1次,根據(jù)體重調(diào)整投飼量。每天早上清除箱內(nèi)糞便,并換水1/4。飼養(yǎng)時(shí)間為8周。養(yǎng)殖水源為曝氣自來(lái)水,試驗(yàn)期間定時(shí)對(duì)水質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控,養(yǎng)殖全程水溫為(27.8±2.2)℃,pH為7.4±0.4,溶解氧>6.5mg/L,氨氮<0.50mg/L,亞硝酸鹽氮<0.06mg/L。1.3抗氧化酶活性測(cè)定飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束,禁食24h后稱重,計(jì)算特定生長(zhǎng)率、成活率、蛋白質(zhì)效率和飼料系數(shù);每箱取3尾魚作為全魚樣品,用于體組成的測(cè)定;每箱取3尾魚于尾靜脈取血,置4℃冰箱過(guò)夜,于4℃條件下以6000r/min離心10min,收集血清,-20℃保存?zhèn)溆?每箱取3尾魚采用搗毀脊髓法處死,取出肝胰臟,立即放入液氮罐中速凍,然后轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱保存。肝胰臟勻漿液在10000×g4℃條件下離心30min,取上清液作為酶活性分析樣品,-20℃保存?zhèn)溆?。飼料原料及魚體樣品均在105℃烘干至恒重,然后進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定。采用凱氏定氮法測(cè)定樣品的總氮含量,將測(cè)定結(jié)果乘以6.25即得粗蛋白質(zhì)含量,粗脂肪含量采用索氏抽提法測(cè)定,粗灰分含量采用高溫(550℃)灰化法測(cè)定。肝胰臟谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)以及血清過(guò)氧化氫酶(CAT)、堿性磷酸酶(AKP)和溶菌酶活性均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。GOT、GPT的活性單位定義為每毫克組織蛋白質(zhì)與基質(zhì)在37℃下作用60min,生成1μmol丙酮酸所需要的酶為1個(gè)卡門氏單位;T-SOD、CuZn-SOD的活性單位定義為每毫克組織蛋白質(zhì)在1mL反應(yīng)液中超氧化物歧化酶(SOD)抑制率達(dá)50%時(shí)所反應(yīng)的SOD量為1個(gè)國(guó)際單位(U);CAT的活性單位定義為25℃、pH7.0條件下,每分鐘分解1μmolCAT所需的酶的量為1個(gè)國(guó)際單位;AKP的活性單位定義為100mL血清在37℃與底物作用15min產(chǎn)生1mg酚所需要的酶的量為1個(gè)金氏單位;溶菌酶的活性單位定義為每分鐘吸光值減少0.001所需血清的量為1個(gè)國(guó)際單位。組織中蛋白質(zhì)含量采用Bradford方法測(cè)定。1)維生素預(yù)混料為每千克飼料提供Vitaminpremixprovidedperkgofdiet:VA25mg,VD35mg,VE40mg,VC500mg,VB112mg,VB66mg,VB120.05mg,VK35mg,核黃素riboflavin5mg,肌醇inositol100mg,泛酸pantothenicacid30mg,煙酸niacin35mg,葉酸folicacid2mg,生物素biotin0.06mg,乙氧基喹啉ethoxyquin150mg,次粉wheatmiddlings14.09g。2)不含F(xiàn)e、Zn、Mn、Cu的微量元素預(yù)混料為每千克飼料提供Iron,zinc,manganeseandcopper-freetraceelementpremixprovidedperkgofdiet:KCl200mg,KI60mg,CoCl2·6H2O8mg,Na2SeO3·5H2O65mg,MgSO4·7H2O3000mg,NaCl117mg,沸石粉zeolitepower1550mg。3)無(wú)機(jī)微量元素預(yù)混料為每千克飼料提供Inorganictraceelementpremixprovidedperkgofdiet:FeSO4·H2O533.3mg(Fe160mg),ZnSO4·H2O231.9mg(Zn80mg),MnSO4·H2O88.1mg(Mn28mg),CuSO4·5H2O16.0mg(Cu4mg),沸石粉zeolitepower4130.7mg。4)氨基酸微量元素螯合物預(yù)混料為每千克飼料提供Aminoacidchelatedtraceelementpremixprovidedperkgofdiet:氨基酸螯合鐵ironaminoacidchelate533.3mg(Fe80mg),氨基酸螯合鋅zincaminoacidchelate266.7mg(Zn40mg),氨基酸螯合錳manganeseaminoacidchelate140.0mg(Mn14mg),氨基酸螯合銅copperaminoacidchelate13.3mg(Cu2mg),沸石粉zeolitepower4046.7mg。5)氨基酸微量元素螯合物組合體預(yù)混料為每千克飼料提供Complexaminoacidchelatedtraceelementpremixprovidedperkgofdiet:氨基酸微量元素螯合物組合體complexaminoacidchelatedtraceelements958.9mg(Fe80mg,Zn40mg,Mn14mg,Cu2mg),沸石粉zeolitepower4041.1mg。1.4蛋白質(zhì)效率及飼料系數(shù)特定生長(zhǎng)率(specificgrowthrate,SGR,%d)=100×[ln末重(g)-ln初重(g)]/試驗(yàn)天數(shù)(d);蛋白質(zhì)效率(proteinefficiencyratio,PER,%)=100×魚體增重(g)/蛋白質(zhì)攝人量(g);飼料系數(shù)(feedconversionratio,FCR)=總干物質(zhì)攝食量(g)/魚體總增重(g);成活率(survivalrate,SR,%)=100×終末魚尾數(shù)(只)/初始魚尾數(shù)(只)。1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)均以平均值表示,采用SPSS11.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-wayANOVA),若差異達(dá)到顯著,則進(jìn)行Tukey多重比較,顯著性水平為P<0.05。2結(jié)果與分析2.1各組羅非魚fcr的比較由表2可知,飼料中補(bǔ)充不同來(lái)源的微量元素Fe、Zn、Mn、Cu后,羅非魚的末重、SGR均顯著升高(P<0.05),同時(shí)有機(jī)組和有機(jī)組合體組羅非魚的末重、SGR均顯著高于無(wú)機(jī)組(P<0.05)。各組羅非魚的PER表現(xiàn)出與SGR相同的趨勢(shì)。此外,有機(jī)組羅非魚的末重、PER均顯著高于有機(jī)組合體組(P<0.05)。羅非魚的FCR與PER表現(xiàn)出相反的趨勢(shì),即對(duì)照組>無(wú)機(jī)組>有機(jī)組合體組>有機(jī)組,各組間差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。試驗(yàn)期間,各組羅非魚的成活率均為100%。同行數(shù)據(jù)肩注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。Inthesamerow,valueswithdifferentsmalllettersuperscriptsmeansignificantdifference(P<0.05).Thesameasbelow.2.2羅非魚臟器干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗灰質(zhì)及肥滿度的變化由表3可知,不同來(lái)源微量元素Fe、Zn、Mn、Cu對(duì)羅非魚魚體干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量以及肥滿度的影響均無(wú)顯著差異(P>0.05)。2.3羅非魚肝胰腺gpt活性檢測(cè)由表4可知,飼料中補(bǔ)充不同來(lái)源的微量元素Fe、Zn、Mn、Cu后,羅非魚肝胰臟GPT和GOT活性顯著升高(P<0.05)。羅非魚肝胰臟GPT活性表現(xiàn)為:對(duì)照組<無(wú)機(jī)組<有機(jī)組合體組<有機(jī)組,各組間差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。各組羅非魚的GOT表現(xiàn)出與GPT相同的趨勢(shì),但有機(jī)組合體組與有機(jī)組間差異不顯著(P>0.05)。2.4對(duì)羅非魚肝臟t-sod和血清cat活性的影響由表5可知,飼料中補(bǔ)充微量元素Fe、Zn、Mn、Cu后,羅非魚肝胰臟T-SOD、CuZn-SOD和血清的CAT、AKP、溶菌酶活性均顯著升高(P<0.05)。有機(jī)組羅非魚肝胰臟T-SOD活性最高,其次是有機(jī)組合體組,隨后是無(wú)機(jī)組,對(duì)照組最差。羅非魚肝胰臟CuZn-SOD活性以有機(jī)組合體組最高,其次是有機(jī)組,隨后是無(wú)機(jī)組,對(duì)照組最差。羅非魚血清CAT活性表現(xiàn)為:對(duì)照組<無(wú)機(jī)組<有機(jī)組合體組<有機(jī)組,各組間差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。有機(jī)組合體組與有機(jī)組羅非魚血清AKP和溶菌酶活性均顯著高于無(wú)機(jī)組和對(duì)照組(P<0.05),但無(wú)機(jī)組與對(duì)照組間以及有機(jī)組合體組與有機(jī)組間均差異不顯著(P>0.05)。3復(fù)合氨基酸微量元素fe、zn、mn、cu與羅非魚的生長(zhǎng)本試驗(yàn)結(jié)果表明,氨基酸微量元素能夠顯著改善羅非魚的生長(zhǎng),是羅非魚飼料中最有效的微量元素補(bǔ)充形式,這與在虹鱒、斑點(diǎn)叉尾鮰上的研究結(jié)果一致。眾所周知,微量元素Fe、Zn、Mn、Cu是人類和動(dòng)物生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)素。Zn缺乏明顯抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、受體生長(zhǎng)激素和生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白mRNA的表達(dá)。像IGF-Ⅰ一樣,Zn能夠促進(jìn)骨膠原蛋白的合成,繼而刺激骨骼的生長(zhǎng)。補(bǔ)Zn能顯著提高IGF-Ⅰ基因表達(dá)水平,與ZnSO4相比,蛋氨酸鋅更大幅度地提高IGF-ⅠmRNA表達(dá),從而有效地促進(jìn)小鼠生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中氨基酸微量元素的供給量?jī)H為無(wú)機(jī)鹽微量元素的50%,卻能夠顯著促進(jìn)羅非魚的生長(zhǎng)。Paripatananont等的試驗(yàn)也證明,當(dāng)用蛋氨酸鋅代替ZnSO4時(shí),可使斑點(diǎn)叉尾鮰飼料中Zn的需要量減少70%。微量元素螯合物中的金屬離子在配位體(如氨基酸)的保護(hù)下,可有效地抵御與其他離子生成難溶的無(wú)機(jī)鹽,緩解礦物質(zhì)間的拮抗競(jìng)爭(zhēng)作用,從而減少了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失,增強(qiáng)了其吸收利用的程度。此外,氨基酸微量元素既是機(jī)體吸收金屬離子的主要形式,又是動(dòng)物體內(nèi)合成蛋白質(zhì)過(guò)程中的中間物質(zhì),所以氨基酸微量元素不僅吸收快,而且可以節(jié)省許多生化過(guò)程,節(jié)約體能消耗,這些因素致使氨基酸微量元素比無(wú)機(jī)微量元素具有更高的生物學(xué)效價(jià)。在其他動(dòng)物如豬、雞、山羊、鮑魚上也有類似的研究報(bào)道。以天然飼料來(lái)構(gòu)成動(dòng)物飼料往往缺乏1種或數(shù)種微量元素,需要在飼料中額外添加。本試驗(yàn)結(jié)果表明,飼料中補(bǔ)充微量元素后羅非魚的生長(zhǎng)性能得到顯著的改善。這說(shuō)明羅非魚飼料中補(bǔ)充微量元素是非常必要的。微量元素生物利用率的研究多集中在無(wú)機(jī)微量元素方面,而有關(guān)有機(jī)微量元素或飼料中微量元素生物利用率的研究報(bào)道則較少。本試驗(yàn)中,氨基酸微量元素的添加量?jī)H為無(wú)機(jī)微量元素的50%,卻能顯著提高羅非魚的生長(zhǎng),說(shuō)明有機(jī)微量元素的利用率高于無(wú)機(jī)微量元素。再者,有機(jī)微量元素產(chǎn)品價(jià)格較高,而且對(duì)這類有機(jī)產(chǎn)品的化學(xué)特性還缺乏一種行之有效的檢測(cè)方法,如產(chǎn)品螯合率的定量測(cè)定,這些因素限制了其研究和應(yīng)用。因此,無(wú)論從提高魚類生產(chǎn)的效益,還是從環(huán)境保護(hù)角度來(lái)講,以氨基酸(肽)微量元素作為水產(chǎn)動(dòng)物飼料添加劑,具有廣闊的應(yīng)用前景,深入研究適合動(dòng)物機(jī)體的最佳螯合物結(jié)構(gòu)形式、最佳添加比例以及氨基酸(肽)微量元素的作用機(jī)制也是非常迫切的。目前,氨基酸微量元素的研究?jī)H局限在單一氨基酸的單一微量元素螯合物方面。本試驗(yàn)探討了復(fù)合氨基酸微量元素(Fe、Zn、Mn、Cu)對(duì)羅非魚生長(zhǎng)的影響,國(guó)內(nèi)外還未見這方面的研究報(bào)道。結(jié)果表明,羅非魚的生長(zhǎng)效果得到顯著改善。一方面可能是復(fù)合氨基酸微量元素減輕或避免了微量元素間拮抗競(jìng)爭(zhēng)作用,并且氨基酸(肽)的微量元素螯合物具有類似二肽的結(jié)構(gòu),又消減了氨基酸吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的競(jìng)爭(zhēng);另一方面位于五元或六元環(huán)螯合物中心的金屬可以通過(guò)小腸絨毛刷狀緣,以氨基酸或肽的形式被吸收,從而使微量元素吸收和利用效率提高。本試驗(yàn)中,氨基酸微量元素組合體的作用效果雖優(yōu)于無(wú)機(jī)微量元素,但要低于單一氨基酸微量元素的同時(shí)添加,這還需要從組合比例、配位體以及螯合強(qiáng)度等方面深入研究。轉(zhuǎn)氨酶與動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝密切相關(guān),通常被認(rèn)為是肝臟功能正常與否的標(biāo)志,當(dāng)肝臟細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)受損時(shí),GOT和GPT釋放進(jìn)入血液造成血液轉(zhuǎn)氨酶活性升高。本試驗(yàn)中,有機(jī)組羅非魚肝胰臟蛋白質(zhì)代謝酶GOT和GPT活性最高,有機(jī)組合體組次之,無(wú)機(jī)組再次之,對(duì)照組最低,表明飼料中蛋白質(zhì)的利用受到影響,PER的變化趨勢(shì)也進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)看法。這在一定程度上是因?yàn)楦我扰K受到損傷的緣故所致,說(shuō)明不同來(lái)源的微量元素對(duì)肝胰臟的影響程度是不同的。氨基酸微量元素由于其特殊的結(jié)構(gòu),較好的化學(xué)穩(wěn)定性,能夠減少吸收過(guò)程中自由基的形成,增強(qiáng)殺菌能力,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力,提高抗