表沒食子兒茶素沒食子酸酯與人血清白蛋白相互作用的光譜學研究

表沒食子兒茶素沒食子酸酯與人血清白蛋白相互作用的光譜學研究

紅茶的主要活性成分為無芒紫藤酸酯（epigalianganamecgg），結構如下。EGCG屬兒茶素類茶多酚,呈現(xiàn)很好的抗氧化活性.研究結果表明:EGCG不僅具有抗腫瘤、抗病毒、抗突變、抗白血病的作用,還具有降壓、降脂、降血糖等作用.對肝臟、腎臟及許多身體重要器官的自由基損傷有一定的保護作用;新的研究還發(fā)現(xiàn),EGCG具有預防中風以及老年癡呆的作用和治療各種神經系統(tǒng)疾病的潛力.人血清白蛋白(humanserumalbumin,HSA)是人血漿中的主要活性蛋白之一,是人血漿中含量最豐富的載體蛋白,是許多內源性或外源性分子和代謝物,包括:各種營養(yǎng)物質、激素、代謝產物以及大多數(shù)藥物的傳輸和分布的載體,研究EGCG在人體與白蛋白相互作用的方式對闡明EGCG的生物活性作用機制具有重要的意義.由于HSA中的色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)殘基能夠發(fā)射內源熒光,本文通過熒光光譜和紫外可見光譜研究EGCG對HSA的熒光猝滅機制,從而得到EGCG與HSA的表觀結合常數(shù)KA,結合位點常數(shù)n及結合距離r,根據熱力學常數(shù)得到結合作用力類型,并通過分子對接計算出結合位點,為研究藥物分子在體內的輸送和代謝提供可靠的實驗數(shù)據和理論依據.1實驗1.1其他化學試劑EGCG(中國藥品生物制品檢定所);HSA,相對分子質量為66000(華蘭生物工程股份有限公司),其他化學試劑均為分析純;實驗用水全部為Milli-Q超純水.Fluorolog-tau-3型熒光光譜儀,Cintra-10eUV-Vis型紫外-可見分光光度計,Autodock3程序.1.2熒光光譜測定在10mL比色管中,依次精確加入1.0mL不同濃度的EGCG溶液和1.0mLHSA溶液(30.0μmol·L-1),并用磷酸緩沖溶液(pH=7.4)精確定容.配制好的溶液EGCG濃度依次為:0、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、10.0和20.0μmol·L-1,HSA的濃度固定為6.0μmol·L-1.溶液放置0.5h后測定熒光光譜,熒光比色皿為1cm,固定激發(fā)波長為300nm,入射和出射狹縫為5nm,掃描溫度為17和37℃.1.3熒光光譜測定精確配制濃度為5.0μmol·L-1的HSA溶液,及濃度為5.0μmol·L-1EGCG溶液.使用熒光光譜儀測定HSA溶液在17℃的熒光光譜.使用紫外-可見分光光度計測定EGCG溶液在17℃,波長為280～800nm下的紫外-可見吸收光譜.1.4分子模擬計算中荷表的建立在Autodock3程序上進行HSA和EGCG的分子對接計算,電荷的計算采用分子模擬計算中常用的RESP(restrainedelectrostaticpotential)方法,使用子程序AutoGrid格點式搜索方法來尋找活性位點.2結果與討論2.1熒光加強過程速率法確定生物小分子與hsa的相互作用引發(fā)熒光猝滅的原因主要有:動態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉移.假定蛋白質的熒光猝滅是一個動態(tài)猝滅或者靜態(tài)猝滅過程,可根據Stem-Volmer方程(1)計算其猝滅速率常數(shù).其中F0、F分別與藥物作用前后蛋白質熒光發(fā)射峰的強度,c(EGCG)為藥物濃度,τ0為猝滅劑不存在時熒光體的壽命,KD為Stem-volmer常數(shù),Kq為猝滅過程速率常數(shù).根據式(1),對于單一的動態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅過程,以熒光分子的熒光強度變化F0/F對猝滅劑濃度c(EGCG)為線性關系,直線斜率代表熒光猝滅過程速率常數(shù)Kq.圖2為17和37℃不同溫度下,熒光強度F0/F-c(EGCG)曲線.從圖中可以看出,F0/F-c(EGCG)呈線性關系,且隨著溫度的升高,猝滅曲線斜率增加.計算得到17和37℃下熒光猝滅過程速率常數(shù)Kq分別為1.632×105和1.903×105L·mol-1.一般情況下,生物大分子的最大動態(tài)猝滅過程的速率常數(shù)Kq<100L·mol-1.因此對于速率常數(shù)大于100L·mol-1的熒光猝滅過程不可能是動態(tài)猝滅而只能是靜態(tài)猝滅過程,由此可以判斷HSA的熒光猝滅是由于EGCG與HSA形成了復合物而引起的靜態(tài)猝滅.當藥物對蛋白質的熒光猝滅主要是靜態(tài)猝滅作用時,其結合常數(shù)(KA)和結合位點數(shù)(n)符合方程(2):lg[(F0/F)/F]-lgc(EGCG)呈線性關系(見圖3),其斜率為n,直線截距為KA,計算結果見表1.小分子與生物大分子的作用力類型一般包括氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力,在溫度變化范圍不大時,ΔH可看作是常數(shù),由熱力學參數(shù)方程(3,4)可以計算出EGCG和HSA在17及37℃下相互作用的熱力學參數(shù)值,結果列于表1.從表1中可以看到EGCG-HSA復合物在形成過程中的ΔG<0,說明結合過程是一個自發(fā)過程.Ross等根據大量的實驗結果,總結了生物大分子與小分子作用力類型的熱力學規(guī)律,ΔS>0可能是疏水和靜電作用力;ΔH>0同時ΔS>0為疏水作用力;ΔH<0時主要為靜電相互作用.由上述結果可知,該體系中EGCG與HSA之間的作用力是以疏水作用力為主.2.4ecgg與hsa的分子對接根據式(6)(7)和(8)可以計算得到R0與r.式中K2為偶極空間取向因子,N為介質折射常數(shù),Φp為HSA的熒光量子產率,J為給體熒光發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊積分(7),即FP(λ)為熒光受體在波長λ處的熒光強度,εD(λ)為受體在波長λ處的摩爾吸光系數(shù).能量轉移效率E可用計算.圖4為室溫下EGCG與HSA摩爾濃度比為1∶1時的吸光度光譜及HSA熒光光譜的重疊光譜,求出二者的重疊積分J=8.138×10-15cm3·L·mol-1,在上述實驗條件下,取向因子供體受體各項隨機分布的平均值K2=2/3,折射指數(shù)N,取水和有機物平均值N=1.336,Φp=0.118,由葉酸與HSA摩爾比為1∶1時絡合物的熒光強度,通過式(8)計算得到E=0.188,計算得到r=3.02nm,r值小于7nm,說明EGCG對HSA的猝滅過程符合非輻射能量轉移理論,從而說明EGCG與HSA結合時是通過非輻射能量轉移機制導致蛋白質的熒光猝滅的.在HSA分子中,有2個藥物分子的主要結合位點siteI和siteII,它們分別位于HSA分子的ⅡA和ⅢA結構亞域.這2個區(qū)域都是由疏水性氨基酸殘基構成疏水空腔,帶有電荷的氨基酸殘基形成了疏水空腔的入口.在siteⅠ結合的藥物通常是電荷位于分子中央的環(huán)狀結構的陰離子,而電荷位于分子末端的鏈狀分子,如脂肪酸等通常結合在siteⅡ位點,茶多酚類藥物由于分子中存在較大的芳香共軛體系,電荷分布在共軛體系的環(huán)上,一般結合在siteⅠ位點.從熒光光譜結果看,EGCG在HSA上只有1個結合位點,它結合在siteI結合位點的可能性較大.分子對接結果表明了EGCG與HSA的最佳結合位點正好在HSA的疏水空腔內(如圖5-a所示),說明其主要作用力類型是疏水作用力,與前面計算結果相吻合.結合的氨基酸殘基主要有GLU400、PHE395、SER435、LYS436、LYS439(如圖5-b所示).又由于EGCG分子中有大量的酚羥基,所以一些氨基酸殘基與EGCG中的酚羥基形成氫鍵,如GLU400、LYS439、LYS439.3熒光加強研究熒光猝滅光譜的實驗結果表明EGCG與HSA之間是自發(fā)的靜態(tài)熒光猝滅過程,紫外可見吸收光譜證明了通過非輻射能量轉移體制導致了蛋白質的熒光猝滅.熒光猝滅光譜以及分子對接方法的實驗結果表明他們之間的作用力類型主要是疏水作用力和氫鍵作用力.這些結果初步闡明了EGCG與HSA結合的機制,為進一步研究EGCG的作用機制奠定了基礎.EGCG-HSA復合物在17和37℃的熒光淬滅光譜如圖1所示.從圖中可以看出,隨著EGCG濃度的增加,HSA的熒光發(fā)射峰出現(xiàn)了明顯的猝滅現(xiàn)象,說明EGCG與HSA生成復合物,并使HSA的空間結構發(fā)生了變化.2.2hsa的表觀連接常數(shù)和位置