間接競爭elisa檢測常用高毒農(nóng)藥的寬譜特異性抗體制備及應(yīng)用

間接競爭elisa檢測常用高毒農(nóng)藥的寬譜特異性抗體制備及應(yīng)用

1農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，促進(jìn)了糧食生產(chǎn)，但也導(dǎo)致了食品和環(huán)境中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留問題。我國在2002年已經(jīng)明令禁止或限制17種有機(jī)磷農(nóng)藥的使用,但有機(jī)磷農(nóng)藥引起的中毒事件仍時(shí)有發(fā)生,需要加強(qiáng)對其監(jiān)測。免疫分析方法被認(rèn)為是一種靈敏、高效、低成本的農(nóng)藥殘留檢測手段。已有許多關(guān)于農(nóng)藥單殘留免疫分析方法的報(bào)道,但有機(jī)磷農(nóng)藥種類多樣且復(fù)配使用現(xiàn)象嚴(yán)重,食品及環(huán)境樣品常殘留多種有機(jī)磷農(nóng)藥,建立農(nóng)藥多殘留免疫分析篩檢方法更具應(yīng)用價(jià)值。目前,針對二甲氧基硫代磷酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行寬譜特異性抗體制備已有報(bào)道,主要是以膦酸基或二甲氧基硫代磷酸酯為半抗原基本結(jié)構(gòu)制備直鏈型半抗原來制備寬譜特異性抗體,但靈敏度普遍偏低。Liu等制備了同時(shí)含二甲氧基硫代磷酸酯和苯環(huán)的通用半抗原,獲得的抗體靈敏度有所提高,但其寬譜特異性仍有待提高。本研究在探討半抗原與抗體及酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法靈敏度的構(gòu)效關(guān)系基礎(chǔ)上,采用特征“次級結(jié)構(gòu)”異源包被策略,建立了靈敏度高,特異性識別譜寬,精密度達(dá)到氣相色譜檢測水平的農(nóng)藥多殘留ELISA檢測方法,為進(jìn)一步開發(fā)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。2實(shí)驗(yàn)部分2.1藥品、試劑與標(biāo)準(zhǔn)品HP1100液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司);DRX-400/600核磁共振儀(德國Burker公司);UV-160A紫外-可見掃描儀(日本Kyoto公司);MK3多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司);6K-15高速冷凍離心機(jī)(德國Sartorius公司);MODEL1575洗板機(jī)(Bio-Rad公司)。農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr.Ehrenstorfer公司);牛血清蛋白(Bovineserumalbumin,BSA,MW67000)、卵清蛋白(Ovalbumin,OVA,MW42700)、二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、弗氏佐劑(美國Sigma公司);N,N-二甲基甲酰胺(DMF,天津大茂化學(xué)試劑廠);辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔(IgG,武漢博士德生物工程有限公司);其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純;葉菜類蔬菜為市售。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1地面器半抗原的合成根據(jù)二甲氧基硫代磷酸酯類農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)特征,設(shè)計(jì)了系列含不同手臂及取代位置的半抗原。其合成路線與結(jié)構(gòu)如圖1所示。其中H1′～H4′按照本研究前期研究報(bào)道方法合成,H5′和R′-NH2為商品化試劑,半抗原H1～H7參照文獻(xiàn)方法合成。2.2.2原材料和鑒定人工抗原制備及鑒定采用文獻(xiàn)方法。2.2.3多烷基抗劑參考文獻(xiàn)的免疫方案,免疫5次,最后一次免疫10d后采血。用辛酸-硫酸銨法純化抗血清,得到4種多克隆抗體(PAb)。2.2.4半抑制濃度用間接競爭ELISA方法分別測定甲基對硫磷在不同反應(yīng)條件下對3種抗體(PAb-H1～PAb-H3)的半抑制濃度(IC50)。用方陣滴定優(yōu)化各包被原濃度和抗體稀釋倍數(shù),建立每個(gè)抗體對12種有機(jī)磷農(nóng)藥的同源ELSIA檢測方法,選擇寬譜特異性最好的抗體建立異源包被間接競爭ELISA方法,測定12種二甲氧基硫代磷酸酯農(nóng)藥的IC50和檢出限(LOD),IC50和LOD值分別為競爭抑制50%和10%時(shí)的藥物濃度。3結(jié)果與討論3.1h-nmr3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms3,tms,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3,l3通常設(shè)計(jì)半抗原時(shí)保留大多數(shù)目標(biāo)分析物質(zhì)共有特征結(jié)構(gòu)有利于制備寬譜特異性的抗體。二甲氧基硫代磷酸酯類農(nóng)藥絕大部分含有二甲氧基硫代磷酸酯和芳香環(huán)兩大特征結(jié)構(gòu),而半抗原手臂為3～6個(gè)長度的烷烴最有利于動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因此,本研究以苯環(huán)和二甲氧基硫代磷酸酯為骨架,設(shè)計(jì)合成了手臂為3～4個(gè)碳原子長度的半抗原H1～H5。另外,異源包被通?？娠@著提高藥物ELISA檢測靈敏度,因而還設(shè)計(jì)合成了H6、H7用于制備包被原。半抗原H1-H7的波譜鑒定數(shù)據(jù)如下:H1:APCI-MSm/z334.3[M+H]+,1H-NMR(600MHz,CDCl3,TMS):δ2.62～2.72(m,4H),3.83(d,J=13.74Hz,6H),7.08(d,J=7.86Hz,2H),7.45(d,J=8.29Hz,2H),8.10(s,1H)。H2:APCI-MSm/z332.1[M+H]+,1H-NMR(600MHz,CDCl3,TMS):δ3.87(d,J=13.80Hz,6H);6.45(d,J=12.82Hz,1H);6.62(d,J=12.86Hz,1H);7.21(d,J=8.91Hz,2H);7.66(d,J=8.94Hz,2H);9.30(s,1H)。H3:APCI-MSm/z287.1[M-H]-,1H-NMR(600MHz,CDCl3,TMS):δ3.87(d,J=13.84Hz,6H);6.39(d,J=15.96Hz,1H);7.22(d,J=7.90Hz,2H);7.55(d,J=8.51Hz,1H);7.75(d,J=15.96Hz,2H)。H4:APCI-MSm/z287.1[M-H]-,1H-NMR(600MHz,CDCl3,TMS):δ3.88(d,J=13.83Hz,6H);6.45(d,J=15.96Hz,1H);7.224～7.246(m,1H);7.36(s,1H);7.39(d,J=4.86Hz,2H),7.76(d,J=15.92Hz,1H)。H5:APCI-MSm/z289.2[M-H]-,1H-NMR(600MHz,CDCl3,TMS):δ2.67(dd,J=7.40Hz,J=8.10Hz,2H);2.94(dd,J=3.90Hz,J=11.36Hz,2H);3.85(d,J=13.72Hz,6H);7.10(dd,J=1.40Hz,J=8.35Hz,2H);7.18(d,J=7.64Hz,2H)。H6:APCI-MSm/z260.1[M-H]-,1H-NMR(600MHz,CDCl3,TMS):δ3.78(d,J=14.17Hz,6H);5.71(d,J=14.85Hz,1H);7.04(d,J=8.81Hz,2H);8.02(d,J=8.65Hz,2H)。H7:APCI-MSm/z254.2[M-H]-,1H-NMR(600MHz,CDCl3,TMS):δ1.38(tt,J=6.25Hz,J=10.43Hz,2H),1.51(td,J=7.47Hz,J=19.43Hz,2H),1.65(td,J=7.44Hz,J=15.14Hz,2H),2.37(t,J=7.39Hz,2H),2.94(d,J=7.99Hz,2H),3.01(s,1H),3.69(d,J=13.66Hz,6H)。H1～H3和H5與BSA偶聯(lián)獲得4個(gè)免疫原;H1～H7與OVA偶聯(lián)獲得7個(gè)包被原。人工抗原的紫外掃描結(jié)果顯示:與相應(yīng)半抗原和載體蛋白比較,偶聯(lián)產(chǎn)物的最大紫外吸收峰在波長215～225nm或270～280nm范圍發(fā)生了明顯變化,證明人工抗原合成成功。3.2抗反應(yīng)時(shí)間和封閉液種類對靈敏度的影響由圖2可知,甲醇濃度(圖2a)與抗體反應(yīng)時(shí)間(圖2b)對ELISA方法的檢測靈敏度影響較大,而二抗反應(yīng)時(shí)間(圖2c)封閉液種類(表1)對方法靈敏度的影響不顯著。綜合考慮多種藥物間的溶解度差異及所需檢測時(shí)間,確定最佳的間接競爭ELISA條件為15%甲醇、5%脫脂奶粉作封閉液、抗體及羊抗兔IgG反應(yīng)時(shí)間為30min。3.3半抗原結(jié)構(gòu)對抗體寬譜特異性的影響結(jié)果表明,在最佳ELISA條件下,4種抗體對12種藥物的寬譜特異性存在顯著差異。由表2中的IC50值和交叉反應(yīng)率(CR)可知,4個(gè)抗體的寬譜特異性從優(yōu)至劣的順序?yàn)镻Ab-H3>PAb-H5>PAb-H1>PAb-H2,說明半抗原結(jié)構(gòu)對抗體寬譜特異性有顯著影響。半抗原H1和H2為含酰胺鍵手臂,其引入可能對磷酸酯基團(tuán)和苯環(huán)的骨架結(jié)構(gòu)電子或空間取向影響較大,導(dǎo)致所獲得的抗體對藥物的競爭識別能力較差;與H5相比,H3手臂上的不飽和鍵使其具有一定的剛性結(jié)構(gòu),偶聯(lián)蛋白后可以使特征基團(tuán)更多地暴露,利于增強(qiáng)動物免疫應(yīng)答,因此免疫所得到的抗體廣譜特異性和親和力最好。3.4h4-ova包被原則和檢出限選取抗體PAb-H3建立了3種異源包被ELISA檢測方法。從表3可見,包被原的異源程度越大,檢測靈敏度越高,此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的一致。同源包被時(shí),PAb-H3只能較好識別9種藥物,而用含間位手臂的H4-OVA作包被原則能夠識別出全部12種藥物;以改變磷酸酯基團(tuán)原子組成的H6-OVA包被,可檢出11種藥物(0.38～16.57mg/kg),且靈敏度相對H4-OVA包被(0.88～23.27mg/kg)有很大提高。使用與免疫半抗原H3異源程度最大的特征“次級結(jié)構(gòu)”包被原H7-OVA包被時(shí)ELISA靈敏度最高(0.10～8.95mg/kg),對8種農(nóng)藥的檢出限(LOD)分別在2.6～104μg/kg之間,達(dá)到相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)要求。因此,采用目標(biāo)待測物共有的二甲氧基硫代磷酸酯特征“次級結(jié)構(gòu)”作為包被半抗原,可顯著提高農(nóng)藥多殘留ELISA檢測靈敏度。3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建以最優(yōu)組合PAb-H3/H7-OVA,在優(yōu)化的ELISA條件下建立了8種二甲氧基