氯原酸對(duì)常見(jiàn)呼吸道病毒體外抑菌的研究

氯原酸對(duì)常見(jiàn)呼吸道病毒體外抑菌的研究

氯原酸是蜂蜜的主要有效成分，也被稱為咖啡酸。隨著我們對(duì)“雙黃連氣霧劑”的深入研究，氯原酸的系統(tǒng)研究已成為這個(gè)主題的第一學(xué)期。特別是近年來(lái)，在世界范圍內(nèi)爆發(fā)的甲狀腺素引起的全球效應(yīng)中，我們必須找到有效的抗高血壓藥物問(wèn)題。藥理研究證明,氯原酸具有一定的抗病毒作用,但對(duì)其抑制具體病毒的研究并不多見(jiàn),因此,我們?cè)谔峒兟仍岬幕A(chǔ)上,對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)體外藥效學(xué)試驗(yàn),本文旨在探討金銀花所含的氯原酸在體外對(duì)常見(jiàn)呼吸道病毒的抑制作用,茲報(bào)道如下。1材料和方法1.1病毒病毒rsv和流感病毒美國(guó)Waters公司2010系列高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC);日本島津SHIMADZU十萬(wàn)分之一電子天平;氯原酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);丹麥TL3072超凈工作臺(tái);日本MODEL304二氧化碳孵箱;日本Olympas顯微鏡;合胞病毒(RSV)、腺病毒3型(Ad3)、腺病毒7型(Ad7)、柯薩奇B組病毒3型(CB3)、柯薩奇B組病毒5型(CB5)、流感病毒甲3亞型(Fa3)、副流感病毒Ⅳ型(PF3)病毒由黑龍江省防疫站病毒研究所提供;對(duì)照藥:雙黃連粉針劑(哈爾濱中藥二廠,批號(hào):970676);病毒靈片(安徽淮南市第三制藥廠,批號(hào):102054)。1.2fa3、pf3病毒毒力檢測(cè)(1)氯原酸由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)植化室用柱層析法從金銀花中提取,經(jīng)HPLC測(cè)定,色譜和光譜與標(biāo)準(zhǔn)品相同,提取純度可達(dá)81.1%。(3)把病毒液用MEM細(xì)胞維持液做10倍系列稀釋,以(2)相同方法測(cè)定RSV、Ad3、Ad7、CB3、CB5病毒的毒力,以致培養(yǎng)細(xì)胞Hep-2病變達(dá)到50%計(jì)算TCID50;用紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)測(cè)定Fa3、PF3病毒的毒力,以雞紅細(xì)胞在V形微量滴定板孔底形成環(huán)狀,周?chē)行∧龎K時(shí)的病毒懸液稀釋度為1個(gè)單位的血凝素。(4)抗RSV、Ad3、Ad7、CB3、CB5病毒實(shí)驗(yàn)用中和試驗(yàn):取三種藥,依據(jù)每藥CC50,依次向下倍比稀釋,取6個(gè)不同濃度,同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照、細(xì)胞對(duì)照、藥物對(duì)照。采用上述病毒的100TCID50與藥物等量稀釋后,接種已成單層細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板,置孵箱培養(yǎng)1~5d,鏡下判定結(jié)果?？笷a3、PF3病毒實(shí)驗(yàn)用血凝抑制試驗(yàn):3種藥按各自CC50,分別取9個(gè)2倍系列稀釋的藥液,分別與4個(gè)單位的Fa3、PF3等量混合,振蕩,在37℃作用1.5h后,在微量滴定板依次倍比用生理鹽水稀釋加入,另設(shè)紅細(xì)胞對(duì)照,病毒對(duì)照,全部孔中各加1%雞紅細(xì)胞懸液0.5mL,45min后記錄結(jié)果。以上試驗(yàn)均做二次,結(jié)果互參。2結(jié)果2.1藥物細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果氯原酸CC50為0.78mg·mL-1,雙黃連粉針CC50為1.563mg·mL-1,病毒靈CC50為6.25mg·mL-1。2.2終點(diǎn)度的判定判定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn):(1)RSV、Ad3、Ad7、CB3、CB5病毒在中和試驗(yàn)中,以能保護(hù)50%的培養(yǎng)細(xì)胞不產(chǎn)生病變的最高稀釋度,為判定藥物抗病毒的終點(diǎn)滴度;(2)Fa3、PF3病毒采用的血凝抑制試驗(yàn),以完全能抑制4單位Fa3、PF3所致的紅細(xì)胞凝集的藥物最高稀釋度為判定終點(diǎn)滴度。結(jié)果見(jiàn)表1。3氯原酸的應(yīng)用從以往的實(shí)驗(yàn)研究中,我們已經(jīng)知道氯原酸的一些藥效學(xué)作用,如一些文獻(xiàn)報(bào)道的:氯原酸及其水解產(chǎn)物咖啡酸均具有廣泛的抗菌作用、中樞興奮作用;促進(jìn)小腸蠕動(dòng)及子宮興奮作用;利膽作用;止血及升高白細(xì)胞作用等;其抗病毒作用,只報(bào)道過(guò)氯原酸抑制培養(yǎng)基中單純皰疹病毒的實(shí)驗(yàn)[1~3]。從以上抗病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以看出,提純的氯原酸細(xì)胞毒性雖增高,但其抗呼吸道常見(jiàn)病毒的效價(jià)亦高于雙黃連粉針劑,明顯高于病毒靈。由此提示,精制的雙黃連作用,要好于未提純的雙黃連。同時(shí),本文亦補(bǔ)充了國(guó)內(nèi)體外氯原酸抗呼吸道病毒的范圍。使我們對(duì)氯原酸有了更深入的了解。這對(duì)于中藥金銀花的開(kāi)發(fā)及抗病毒中藥雙黃連的研究,無(wú)疑具有巨大的推動(dòng)作用。通過(guò)這一實(shí)驗(yàn)我們知道,氯原酸對(duì)呼吸道最常見(jiàn)、最主要的合胞病毒、柯薩奇B組3型病毒等具有明顯的抑制作用,強(qiáng)于雙黃連粉針,濃度約0.05mg·mL-1即能體外抑制合胞病毒生長(zhǎng),濃度約0.1mg·mL-1即可抑制柯薩奇B組3型病毒的體外生長(zhǎng);對(duì)于腺病毒7型,濃度需0.4mg·mL-1可抑其體外生長(zhǎng);對(duì)于腺病毒3型和柯薩奇B組5型,濃度需0.8mg·mL-1可抑制其體外生長(zhǎng);對(duì)于我國(guó)東北地區(qū)冬季經(jīng)常流行的流感病毒3亞型抑制作用較弱,濃度需12.5mg·mL-1才能體外抑制;對(duì)于副流感病毒Ⅳ型作用更弱,需50mg·mL-1才能體外抑制。臨床應(yīng)用多年的抗病毒藥病毒靈在體外試驗(yàn)中療效不佳。由此可以看出,提純的氯原酸對(duì)于呼吸道最常見(jiàn)的幾種病毒大多具有很好的體外抑制作用,這與主要含有氯原酸的金銀花多應(yīng)用于呼吸道病毒感染是緊密相連的,進(jìn)一步說(shuō)明氯原酸做為金銀花的主要有效成分是有一定的實(shí)驗(yàn)與理論基礎(chǔ)的。(2)分別取氯原酸、雙黃連粉針、病毒靈的10%濃度液體150uL,用細(xì)胞維持液由高向低2倍系列稀釋成各濃度液,每組藥按不同濃度分裝在10支離心管中,第