響應(yīng)面法優(yōu)化反膠束法萃取葵花蛋白工藝

響應(yīng)面法優(yōu)化反膠束法萃取葵花蛋白工藝

奎花籽是世界上第二大的油提煉物，含有20%30%的蛋白質(zhì)，必要氨基酸含量高。這是富含營養(yǎng)化學(xué)資源和蛋白質(zhì)的資源。反膠束法萃取蛋白質(zhì)主要包括2個(gè)步驟:前萃取和后萃取。所謂前萃取是指在宏觀兩相(有機(jī)相和水相)界面間的表面活性劑層同鄰近的蛋白質(zhì)發(fā)生靜電作用而變形,接著在兩相界面形成了包含有生物活性物的反膠束,此反膠束擴(kuò)散進(jìn)入有機(jī)相,從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的萃取分離;所謂后萃取即將反膠束溶液和KCl溶液接觸,調(diào)節(jié)溶液的pH值和離子強(qiáng)度等因素,使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入水相[3～6]。本文主要研究了在反膠束法后萃取脫脂葵花蛋白的過程中,各種工藝參數(shù)對后萃取過程的影響,并且在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面分析確定了反膠束法后萃取脫脂葵花蛋白的最佳工藝條件。反膠束法具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景,可提高葵花蛋白資源的利用率。1試驗(yàn)材料和方法1.1化學(xué)試劑的制備脫脂葵花粕,試驗(yàn)室自制。二辛基琥珀酸磺酸鈉(AOT)為試驗(yàn)試劑;異辛烷、氯化鉀、氫氧化鈉、硼酸、濃硫酸、碳酸氫鈉、檸檬酸、鹽酸、磷酸氫二鈉和氯化鈉等均為國產(chǎn)分析純,購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器、TDL-5-A臺式離心機(jī)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱和PHS-3C精密pH計(jì)。1.2測試方法1.2.1反膠束法前萃取脂牡丹花粕蛋白準(zhǔn)確稱取一定量的脫脂葵花粕粉加入到反膠束溶液中,用磁力攪拌器37℃攪拌1h,然后5000r/min離心20min,取上清液(即為前萃液),測量體積,取5mL萃取液消化,最后定氮,計(jì)算反膠束法前萃取脫脂葵花粕蛋白含量。1.2.2kcl緩沖溶液的制備將前萃液加入到等體積的具有一定pH值(8.5、9.0、9.5、10.0和10.5)和離子強(qiáng)度(0.50、0.75、1.00、1.25和1.50mol/L)的KCl緩沖溶液,在磁力攪拌器上攪拌一定時(shí)間(20、30、40、50和60min),萃取溫度均為40℃。然后將上述溶液置于分液漏斗中,靜置,使其分層,取下層水相(蛋白質(zhì)中殘留部分AOT)5mL進(jìn)行消化,用微量的凱式定氮法分析其蛋白質(zhì)含量,計(jì)算蛋白質(zhì)后萃取率。蛋白質(zhì)后萃取率按如下公式計(jì)算:1.2.3單次萃取時(shí)間和萃取效率(1)KCl濃度對脫脂葵花蛋白后萃取率的影響。分別量取50mL萃取液置于5個(gè)干凈的250mL燒杯中,再向其中加入KCl濃度分別為0.50、0.75、1.00、1.25和1.50mol/L,pH值10.0的KCl緩沖溶液50mL,萃取溫度為40℃。在磁力攪拌器上攪拌50min。之后倒入分液漏斗中,分層后取下層液體(含蛋白質(zhì)),從中取5mL進(jìn)行消化,最后用凱式定氮法測出蛋白質(zhì)含量,計(jì)算后萃取率。(2)pH值對脫脂葵花蛋白后萃取率的影響。分別量取50mL萃取液置于5個(gè)干凈的250mL燒杯中,再向其中各加入用1.0mol/L的KCl,pH值分別為8.5、9.0、9.5、10.0和10.5的KCl緩沖溶液各50mL,萃取溫度為40℃。在磁力攪拌器上攪拌50min。之后倒入分液漏斗中,分層后取下層液體(含蛋白質(zhì)),從中取5mL進(jìn)行消化,最后用凱式定氮法測出蛋白質(zhì)含量,計(jì)算后萃取率。(3)萃取時(shí)間對脫脂葵花蛋白后萃取率的影響。分別量取50mL萃取液置于5個(gè)干凈的250mL燒杯中,再向其中各加入50mLKCl濃度為1.0mol/L,pH值10.0的KCl緩沖溶液,萃取溫度為40℃。在磁力攪拌器上分別攪拌20、30、40、50和60min。之后倒入分液漏斗中,分層后取下層液體(含蛋白質(zhì)),從中取5mL進(jìn)行消化,最后用凱式定氮法測出蛋白質(zhì)含量,計(jì)算后萃取率。1.2.4響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案,以萃取時(shí)間、緩沖液pH值和KCl濃度3個(gè)因素為自變量,以脫脂葵花蛋白后萃取率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。2結(jié)果與分析2.1鹽濃度對膜分離、萃取率的影響由圖1可知:當(dāng)KCl濃度從0.50mol/L增加到1.25mol/L時(shí),蛋白后萃取率顯著增加,再繼續(xù)增加KCl濃度,蛋白后萃取率呈現(xiàn)下降的趨勢,這是因?yàn)殡x子強(qiáng)度增加時(shí),在膠束內(nèi)部產(chǎn)生靜電屏蔽作用,使蛋白質(zhì)分子與AOT分子之間的靜電作用減弱,發(fā)生解聚,而且,高離子強(qiáng)度產(chǎn)生的屏蔽效應(yīng)會(huì)使表面活性劑極性頭之間的斥力減弱,水核半徑減小,這些因素有利于蛋白質(zhì)分子進(jìn)入到緩沖溶液中,使蛋白后萃率增加。但是鹽濃度過高,脫脂葵花蛋白的后萃率隨之下降,其可能原因是當(dāng)離子濃度過大時(shí),鹽對蛋白質(zhì)的鹽析作用也增強(qiáng),造成蛋白質(zhì)的提取率下降。所以在響應(yīng)面分析中,本研究選擇KCl濃度1.25mol/L作為中心點(diǎn)。2.2ph值對蛋白萃取效率的影響由圖2可知:KCl緩沖液pH值從8.5變化到9.5時(shí),蛋白后萃取率顯著增加,這符合蛋白質(zhì)在水中的溶解特性,主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的后萃率與蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度有非常大的關(guān)系。而當(dāng)pH值從9.5增加到10.5時(shí),蛋白后萃率又顯著降低,這可能是由于隨著pH值繼續(xù)增加,蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷數(shù)量增加,使蛋白質(zhì)和反膠束的疏水作用增強(qiáng),不利于蛋白質(zhì)從反膠束溶液進(jìn)入水相,因此蛋白質(zhì)后萃率降低。通過本試驗(yàn)可知,在反膠束法提取脫脂葵花蛋白的后萃取過程中,與AOT結(jié)合的脫脂葵花蛋白在緩沖溶液中的最佳溶解pH值是9.5。2.3萃取時(shí)間的影響由圖3可知:隨著萃取時(shí)間的增加,脫脂葵花籽蛋白后萃取率在20～40min急劇上升,50min時(shí)達(dá)到最大值,到60min左右基本保持平衡,原因是隨著萃取時(shí)間的延長,蛋白分子逐漸轉(zhuǎn)入緩沖溶液中,使蛋白后萃取率增加。由圖說明50min為反膠束法后萃取脫脂葵花蛋白的最適合的提取時(shí)間。2.4反膠束萃取條件的優(yōu)化在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,固定萃取溫度40℃,選擇萃取時(shí)間、緩沖液的pH值和KCl濃度3個(gè)因素為自變量,采用中心組合設(shè)計(jì)對反膠束法后萃取脫脂葵花蛋白的工藝條件做進(jìn)一步優(yōu)化。2.4.1模型方差分析Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及相應(yīng)的響應(yīng)值在表1中給出。由SAS對表1中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,獲得二次多項(xiàng)回歸方程為:由表2的回歸方程的方差分析可知:模型p=0.0209<0.05,表明模型方程顯著,即不同萃取條件對脫脂葵花蛋白后萃取率影響顯著;整個(gè)模型的R2為0.9289,變異系數(shù)為9.1370,說明模型的擬合度很好,可以準(zhǔn)確地反應(yīng)自變量之間的關(guān)系。由表2的回歸方程的各項(xiàng)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知:一次項(xiàng)(p<0.05)、二次項(xiàng)(p<0.05)對脫脂葵花蛋白后萃取率影響顯著,而交互相作用不顯著(p>0.05)。2.4.2回歸方程的穩(wěn)定性由響應(yīng)曲面分析可知:X1(KCl濃度)對響應(yīng)值的影響最大,其次為X2(pH值),而X3(萃取時(shí)間)對響應(yīng)值的影響較小。另外,回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn),穩(wěn)定點(diǎn)是極大值點(diǎn),通過嶺嵴分析(ridgeanalysis)得到極大值。所對應(yīng)的各主要因素(X1、X2、X3)的編碼值分別為(0.404560、-0.027136、0.011218),即最佳條件是:KCl濃度1.35mol/L、緩沖液pH值9.49和萃取時(shí)間50min,此時(shí)脫脂葵花蛋白后萃率達(dá)到52.54%,與模型的預(yù)測值(53.17%)基本相符。3能耗低,易操作利用反膠束的方法從脫脂葵花粕中萃取蛋白質(zhì)是可行的,與傳統(tǒng)的葵花蛋白提取方法——鹽溶堿提酸沉法