egcg及其氧化產(chǎn)物的抑菌活性研究

egcg及其氧化產(chǎn)物的抑菌活性研究

兒茶素是茶多酚中的一種活性物質(zhì)。它具有抗高血壓、氧化、無菌、抗癌、抗癌等多種生理效果。過去人們常常認為其酚羥基氧化后會導致其活性降低或喪失。但人們逐漸發(fā)現(xiàn)兒茶素類氧化產(chǎn)物也具有很高活性,甚至在某些方面超過了未氧化的兒茶素。目前,國內(nèi)外對兒茶素氧化產(chǎn)物的活性研究主要集中在抗氧化方面,而對其抑菌作用的報道尚不多見。且以往研究主要以紅茶提取物和茶色素為研究對象,而紅茶提取物和茶色素除含有多酚氧化產(chǎn)物外還含有黃酮醇類,咖啡堿及其它成分,并不能完全代表兒茶素類氧化產(chǎn)物的生物活性。因此本文以兒茶素中含量最高,活性最強的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)為前體物質(zhì)進行體外氧化,比較EGCG及其不同氧化級分的抑菌作用,為深入認識酚類氧化產(chǎn)物提供參考。1材料和方法1.1微生物成果質(zhì)量指標表沒食子兒茶素沒食子酸酯,純度大于99%,購自美國Sigma公司。供試大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、黑曲霉(Aspergillusniger)、微小毛霉(Mucorpusillus)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)均由華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院微生物教研室提供。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯(PDA)培養(yǎng)基。1.2實驗方法1.2.1中性氧化反應(yīng)參照WanXC的方法,將K3Fe(CN)6與NaHCO3按一定比例配制成化學氧化劑,滴加到EGCG溶液中,啟動氧化反應(yīng)。水浴25℃,反應(yīng)15min后,立即在pH7.0條件下,用乙酸乙酯萃取,得到中性氧化級分EOFA(EGCGoxidationfractionA);再立即調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至2.0,用乙酸乙酯萃取,得到酸性氧化級分EOFB(EGCGoxidationfractionB)。將兩級分進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),冷凍干燥備用。1.2.2hplc分析條件1.2.2.流動相aa色譜柱PhenomenexC18(4.6mm×250mm,5μm),流動相A為乙酸(2%);流動相B為乙腈;流速0.8mL/min,柱溫40℃,檢測波長280nm,進樣量10μL;0～50min流動相B線性梯度變化8%～31%,53min時回到8%。1.2.2.干燥溫度cs電噴霧電離(ESI),掃描方式:負離子掃描(ESIm/z100～2000),噴霧氣壓力30.0psi,干燥溫度300℃,干燥氣體的流速8.0L/min,毛細管電壓為4.0kV。1.2.3用于培訓的平板制造商配制好的各種菌株的培養(yǎng)基,經(jīng)高壓蒸汽消毒滅菌后,冷卻至50～60℃,無菌操作傾入干熱滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi),迅速搖勻,冷卻凝固后備用。1.2.4懸浮液的制備把各種供試菌菌種用其適宜的斜面培養(yǎng)基進行活化后,用無菌生理鹽水制成含菌量約為106～107CFU/mL的菌懸液。1.2.5抗菌試驗抑菌實驗采用濾紙片法。用打孔器將濾紙制成直徑為6mm的圓片,高溫蒸汽殺菌后烘干備用。1.2.5.抑菌圈測定將EGCG、EOFA、EOFB配置成2mg/mL溶液,以無菌操作將濾紙片浸泡于其中12h。菌懸液注100μL到平板上,用涂布棒涂抹均勻后放置約20min。用無菌鑷子取浸泡濾紙片,瀝干后貼到培養(yǎng)基上,于37℃恒溫培養(yǎng)細菌24h,28℃恒溫培養(yǎng)真菌48h,測量抑菌圈大小,以無菌水作對照,兩者直徑作比值。重復(fù)兩次取平均值。1.2.5.最低抑制濃度測定將EGCG、EOFA、EOFB溶液用無菌水進行稀釋,制備系列濃度稀釋液,測定樣品對所選菌株的最低抑制濃度(MIC),實驗過程同1.2.5.1。重復(fù)兩次取平均值。1.2.6溫度對抑菌圈的影響將EGCG、EOFA、EOFB溶液置不同溫度下處理30min,用濾紙片法測定不同溫度處理下樣品的抑菌圈直徑,并以無菌水作對照,兩者直徑作比值。重復(fù)兩次取平均值。1.2.7不同ph值的檸檬酸緩沖液抑菌圈的測定EGCG、EOFA、EOFB溶液用碳酸氫鈉和檸檬酸緩沖液調(diào)配成不同pH,用濾紙片法測定不同pH下樣品的抑菌圈直徑,并以不同pH值的緩沖液作對照,兩者直徑作比值。重復(fù)兩次取平均值。1.2.8鹽濃度對抑菌圈的影響EGCG、EOFA、EOFB用不同濃度的氯化鈉溶液溶解,測定不同鹽濃度下樣品的抑菌圈直徑,并以不同濃度氯化鈉溶液作對照,兩者直徑作比值。重復(fù)兩次取平均值。2結(jié)果與討論2.1兒茶素氧合合成高效聚氧合物的制備方法由圖1可知,級分EOFA主要含有EGCG及氧化產(chǎn)物1、2;級分EOFB主要含有氧化產(chǎn)物1、3。HPLC/MS分析表明,產(chǎn)物1m/z911,產(chǎn)物2m/z929,產(chǎn)物3m/z911,EGCGm/z457。Lewis和Sang等人曾報道,兒茶素氧化聚合物可通過兒茶素B環(huán)或D環(huán)上的-OH氧化成鄰醌,再由鄰醌配對發(fā)生氧化偶合或是兩單體間通過C-C單鍵相連聚合而成。根據(jù)分子量推測產(chǎn)物1、產(chǎn)物3為EGCG脫氫二聚體([2M-4H],MEGCG=458Da),二者雖然分子量相同,但結(jié)合方式不相同,從而導致極性上的差異;產(chǎn)物2為EGCG通過B環(huán)偶合而得的鄰醌二聚體。因此,EGCG氧化聚合的主要產(chǎn)物為EGCG二聚體。2.2其他菌株的抑菌活性表1為EGCG、EOFA、EOFB對不同菌株的抑制效果。結(jié)果表明,EGCG及其氧化級分對霉菌、酵母無明顯的抑制作用,而對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有較為明顯的抑制作用。被抑制的細菌中既有革蘭氏陽性菌又有革蘭氏陰性菌,既有球菌,又有桿菌,可見EGCG及其氧化級分有著廣譜的抑菌作用。抑菌效果為:EGCG>EOFA>EOFB,氧化級分的抑菌活性略低于EGCG。分析其原因為:隨聚合度的增加,兒茶素氧化產(chǎn)物的分子量增大,難以透過細菌的細胞膜;加之,受大分子的空間位阻效應(yīng)影響,酚羥基的活性被削弱,從而導致了抑菌能力的下降。2.3ecgg、eofa、eofb的濃度對抑菌活性的影響EGCG、EOFA、EOFB對三種細菌最低抑菌濃度結(jié)果見表2,可看出隨著EGCG、EOFA、EOFB濃度的降低,它們的抑菌活性也隨之降低。EGCG、EOFA及EOFB對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度均為0.2mg/mL,對枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度均為0.01mg/mL。2.4抑菌活性的影響以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌為供試菌,不同溫度處理下樣品的抑菌效果見表3。由表可知,溫度對樣品的抑菌活性有一定影響,特別是在40℃下加熱30min,EGCG、EOFA抑菌活性大幅下降,但隨溫度進一步升高,抑菌活性保持穩(wěn)定;級分EOFB在80℃處理30min后無抑菌活性,這可能是因為EOFB中,氧化產(chǎn)物1和3的EGCG脫氫二聚體結(jié)構(gòu)對熱不穩(wěn)定,在高溫下易降解所致。2.5ph值對ecgg及氧化級分抑菌效果的影響以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌為供試菌,不同pH值下樣品的抑菌效果見表4。由表可知,pH值對樣品抑菌有較明顯的影響,在pH為4～6的弱酸性范圍,EGCG及氧化級分抑菌效果好。在強酸及堿性范圍內(nèi),抑菌效果明顯下降。這是因為EGCG及其氧化產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上具有較多酚羥基,為弱酸性物質(zhì),經(jīng)強酸或強堿處理后會發(fā)生不同程度的轉(zhuǎn)化,從而導致抑菌活性降低。2.6抑菌效果分析以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌為供試菌,不同氯化鈉濃度下樣品的抑菌效果見表5。由表可知,樣品中加一定量的氯化鈉可增強它們的抑菌活性,當氯化鈉濃度為0.8mol/L時,樣品的抑菌效果最為明顯,可能為氯化鈉與樣品的協(xié)同增效作用。3ecgg及其氧化級分的抑菌活性本研究結(jié)果表明,EGCG及其氧化級分對細菌有較強的抑制作用,對真菌、酵母菌無明顯的抑制作用。其中EGCG、EOFA及EOFB對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度均為0.2mg/