第3章基因工程高二生物必背知識清單（滬科選擇性必修3）

第3章基因工程一、基因工程賦予生物新的遺傳特性1.基因工程的誕生是多學(xué)科綜合發(fā)展的成果基因工程：將一種或多種生物（供體）的基因與運載工具在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀。由于重組拼接的基因和運載工具都是DNA分子，因此，基因工程也稱為重組DNA技術(shù)?；蚬こ淘谶z傳學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等生物科學(xué)分支學(xué)科的基礎(chǔ)上問世。2.原理：基因重組（基因重組是指整段DNA在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間、甚至在不同物種之間進行交換，并能在新的位置上復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，是生物界的普遍現(xiàn)象。）（減一前：交叉互換；減一后：自由組合；非正?；蛑亟M：R型轉(zhuǎn)化成S型，R型將S型菌控制多糖莢膜的基因轉(zhuǎn)入到自己的細(xì)胞當(dāng)中，并且整合到的自己DNA分子了）3.基因拼接理論基礎(chǔ)：1）揭示DNA是遺傳物質(zhì)；2）確立DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則；3）破譯遺傳密碼（生物共用一套遺傳密碼）4.技術(shù)支撐：1）發(fā)現(xiàn)運載工具；2）開發(fā)工具酶；3）實現(xiàn)DNA體外重組5.意義：①打破生殖隔離，定向地改造生物的遺傳性狀，獲得人類所需要的品種或產(chǎn)物。②現(xiàn)代生物工程的核心技術(shù)。2.基因工程改善人類的生活品質(zhì)醫(yī)學(xué)：制備疫苗（乙肝疫苗）農(nóng)牧業(yè)：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉食品方面：鮮味劑二、基因工程是一種重組DNA技術(shù)人胰島素大規(guī)模生產(chǎn)：首先獲取人胰島素基因（目的基因），其次將之安裝在合適的載體上，然后把重組好的DNA分子（表達載體）導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞中，并對目的基因及其表達產(chǎn)物進行鑒定，最后借助這種含重組DNA分子的受體細(xì)胞大量生產(chǎn)重組人胰島素。重組需要三種基本工具1．限制性內(nèi)切核酸酶來源主要來自原核生物種類數(shù)千種作用識別雙鏈DNA特定的序列（長度通常為4～8個堿基對（bp），稱為識別序列），能斷裂識別序列內(nèi)部或兩側(cè)相鄰兩個脫氧核苷酸之間的化學(xué)鍵（磷酸二酯鍵），從而切開DNA分子的兩條鏈。結(jié)果EcoRI限制酶能專一識別5'GAATTC3'序列，并在G和A之間將這段序列切開。如果線形DNA分子兩個端點的單鏈突出部分呈序列互補性且方向相同，那么它們便能在較低溫度下重新“粘”在一起（即互補堿基之間形成氫鍵），這樣的單鏈末端稱為黏性末端。補充：限制酶的選擇原則（1）不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。（2）保留標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。（3）確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。（4）限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子含某種限制酶的細(xì)菌的DNA分子不具備這種限制酶的識別序列，或者甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到了限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。2.DNA連接酶作用：能封閉雙鏈DNA分子中的單鏈“缺口”，即一條鏈上相鄰兩個脫氧核苷酸之間斷開的磷酸二酯鍵（連接兩個片段），因此特別適合將兩個黏性末端牢固地連為一體。3.載體利用載體的原因：大部分DNA片段（尤其是目的基因）并不具備可遺傳的自我復(fù)制能力，因為缺少復(fù)制所必需的特定DNA序列。而且，即便一個DNA片段能在原供體細(xì)胞中復(fù)制，這種復(fù)制能力一般情況下也難以在受體細(xì)胞中正常發(fā)揮。①載體（一類雙鏈環(huán)狀DNA分子）：能在受體細(xì)胞中獨立復(fù)制的DNA分子。②種類：質(zhì)粒DNA（微生物細(xì)胞內(nèi)的雙鏈環(huán)狀DNA分子）、病毒DNA。③特點：條件原因穩(wěn)定存在并能自我復(fù)制或整合到受體DNA上，當(dāng)中的基因能進行轉(zhuǎn)錄能使目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴增有一個至多個限制酶切割位點可攜帶多個或多種外源基因具有特殊的標(biāo)記基因便于重組DNA分子的篩選無毒害作用對受體細(xì)胞無毒害作用，避免受體細(xì)胞受到損傷攜帶抗生素抗性等基因幫助宿主抵御環(huán)境不利因素的影響補充：比較以下幾種酶的作用：限制內(nèi)切核酸酶DNA連接酶DNA解旋酶DNA聚合酶作用切割DNA分子（切割磷酸二酯鍵），獲得目的基因連接目的基因與載體，形成磷酸二酯鍵催化氫鍵斷裂使DNA雙鏈分開以單鏈DNA為模板，將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端，形成磷酸二酯鍵作用結(jié)果切割DNA分子將兩個DNA片段連接成完整的DNA分子將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈將單個的脫氧核苷酸連接到DNA單鏈末端作用時間基因工程中獲得目的基因及切割載體基因工程中目的基因與載體的重組DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄DNA復(fù)制補充：DNA片段經(jīng)限制酶處理后產(chǎn)生的相同黏性末端，再經(jīng)過DNA連接酶處理后，形成的新的識別序列，能否再被所用的限制酶識別。(1)若兩個相同黏性末端都是由同種限制酶(EcoRⅠ)切割后所得，能再被所用的限制酶識別(如圖)。(2)若兩個相同黏性末端是由不同限制酶切割所得，不能再被所用的限制酶識別(如圖)。是獲取目的基因的主要方法目的基因：人們?yōu)榱诉_到基因工程特定目標(biāo)而導(dǎo)入受體細(xì)胞的基因。1．獲取目的基因方法：=1\*GB3①如果目的基因的部分序列已知，可采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），這是獲取目的基因的主要方法；②如果目的基因的完整序列已知，可采用化學(xué)合成法；=3\*GB3③如果基因序列未知，采用大規(guī)模篩選的方法。（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)：模擬細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程的DNA體外擴增技術(shù)。=1\*GB3①特點：可由微量的DNA樣品特異、高效、準(zhǔn)確地擴增特定區(qū)域的DNA序列。②前提條件：目的基因兩側(cè)的序列已知，以便人工化學(xué)合成DNA引物。=3\*GB3③要求：模板：目的基因兩條鏈原料：（dNTP）四種脫氧核苷三磷酸，即dCTP、dATP、dGTP、dTTP（＋d能量和脫氧核苷酸），還有緩沖液系統(tǒng)（保證pH合適）酶：耐熱DNA聚合酶(Taq酶)。（黃石公園熱泉里面發(fā)現(xiàn)的，需要Mg2+激活酶的活性）引物：人工合成的與模板DNA發(fā)生堿基互補配對的兩條單鏈DNA片段。（引物從3’端開始堿基互補配對）⑤過程：變性：系統(tǒng)溫度升至95℃，使待擴增雙鏈DNA樣品變性，形成單鏈模板；退火：系統(tǒng)溫度緩慢降至55～68℃，使兩條不同的引物分別與兩條單鏈DNA模板（3’端）結(jié)合；聚合：系統(tǒng)溫度升至75℃左右，（耐熱）DNA聚合酶催化（脫氧核苷酸一個一個）從兩條引物的一端以相反方向合成新的DNA子鏈。重復(fù)上述操作n次，理論上即可從1分子的雙鏈DNA模板擴增至2n個分子。上述系統(tǒng)溫度升降均由PCR擴增儀自動完成。補充：PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較名稱PCR技術(shù)DNA復(fù)制場所體外（PCR擴增儀中）細(xì)胞內(nèi)（主要是細(xì)胞核中）解旋方式DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化酶耐高溫的DNA聚合酶DNA解旋酶、DNA聚合酶溫度條件在較高溫度下進行，需控制溫度細(xì)胞內(nèi)溫和條件合成對象DNA片段DNA分子相同點均需要模板（DNA雙鏈）、原料（四種脫氧核苷三磷酸）、能量補充：(1)在PCR過程中實際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。(2)引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細(xì)胞內(nèi)的DNA進行復(fù)制時，也需要引物，一般為RNA片段。(3)真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。(4)得到目的基因至少要經(jīng)過三個循環(huán)(5)PCR擴增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律循環(huán)次數(shù)123nDNA分子數(shù)2482n含引物A(或B)的DNA分子數(shù)1372n－1同時含引物A、B的DNA分子數(shù)0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗的引物數(shù)量2＝21＋1－26＝22＋1－214＝23＋1－22n＋1－2的提取和鑒定(一)DNA的提取和分離原理：在一定濃度的乙醇或異丙醇溶液中，DNA溶解度下降，可沉淀形成纖維狀絮團，飄浮其中。步驟：1.配制50mL生理鹽水：取50mL離心管，將克NaCl溶解到50mL蒸餾水中，備用。2.取另外一支50mL離心管，裝入10mL乙醇，蓋上管蓋，放置冰箱冷藏。3.用解剖刀將肝臟樣品切成小塊，取一藥匙肝臟樣品放入培養(yǎng)皿中。4.培養(yǎng)皿中放入10mL生理鹽水，用藥匙碾壓、磨碎肝臟，使其在生理鹽水中產(chǎn)生懸浮的肝臟細(xì)胞。5.在試管架上放置一支試管，再在試管上放置一支漏斗，將紗布折成四層，放入漏斗中形成過濾裝置。將肝臟懸浮液倒入漏斗，經(jīng)紗布過濾，收集肝細(xì)胞懸浮液。6.用移液管取0.5mL十二烷基硫酸鈉（SDS）至肝細(xì)胞懸浮液試管中，輕輕晃動，混合溶液。7.用移液管移取約4mL肝細(xì)胞懸浮液到另一支試管中。8.握住試管，使其微微傾斜，緩緩加入已預(yù)冷的8mL乙醇。9.將試管放到試管架上，觀察肝細(xì)胞懸浮液和乙醇混合液的接觸面。在乙醇混合液的接觸面上會慢慢形成絮狀白色物質(zhì)，這種物質(zhì)就是溶液中析出的DNA。10.緩緩將玻璃棒伸入試管，當(dāng)玻璃棒穿過DNA層時，輕輕轉(zhuǎn)動玻璃棒，使析出的DNA纏繞在玻璃棒上。（二）DNA的鑒定原理：DNA大分子的脫氧核糖在酸性條件下加熱，能與二苯胺（1%的冰醋酸溶液，重量體積比W/V）發(fā)生反應(yīng)，生成藍色化合物。步驟：1.將上述纏繞在玻璃棒上的DNA樣品放入3mL蒸餾水中，加熱15min，促進DNA溶解。2.取上述DNA溶液1mL于另一支試管中，加入2mL二苯胺試劑，混勻。3.上述混合液于60℃加熱15min，觀察并記錄實驗結(jié)果。3．切割和連接是構(gòu)建達載體的主要方式表達載體的構(gòu)建：將PCR擴增獲得的目的基因和合適的載體用相應(yīng)的限制性內(nèi)切核酸酶切割出黏性末端（簡稱“切”），然后加入DNA連接酶將兩者連接為一體（簡稱“接”），形成含目的基因且能表達的表達載體?；虮磉_在載體包括：目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因（復(fù)制原點：可以進行啟動自我復(fù)制的東西）啟動子:RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄終止子:RNA聚合酶脫離部位，終止轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因:用于鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，例如抗生素抗性基因，熒光蛋白合成基因等。注意事項：（1）由于目的基因兩側(cè)的黏性末端相同，因而能以正反兩種方式等概率接入載體，但在基因工程大多數(shù)應(yīng)用中，只有一種方式是可用的。（2）同樣，由于載體片段兩側(cè)的黏性末端也相同，因而在連接時載體兩個黏性末端可以自我環(huán)化，導(dǎo)致載體“空載”（即非重組DNA分子）。（3）根據(jù)DNA連接酶的工作原理，目的基因和載體DNA只需黏性末端相同便能有效連接，也就是說，兩種DNA并不必須用同一種酶切開。（4）如果使用兩種識別序列不同、但黏性末端相同的限制性內(nèi)切核酸酶分別切開目的基因和載體DNA，那么兩者連接后原來的限制性內(nèi)切核酸酶識別序列會消失，也就是說，不能用相應(yīng)的限制性內(nèi)切核酸酶從重組DNA分子中重新“卸下”目的基因。補充：單酶切和雙酶切（5）單酶切的結(jié)果目的基因和質(zhì)粒的正向連接，目的基因和質(zhì)粒的反向連接，目的基因或質(zhì)粒自連。只有目的基因和質(zhì)粒的正向連接是基因工程中所需要的重組DNA。雙酶切能保證目的基因與運載體定向連接，防止目的基因與運載體發(fā)生任意連接或自連。補充：回顧啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(編碼氨基酸)翻譯的結(jié)束信號(不編碼氨基酸)4．將DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞原因：只有導(dǎo)入受體細(xì)胞，才能借助細(xì)胞內(nèi)的基因表達系統(tǒng)使目的基因所蘊含的遺傳信息得以表達。受體細(xì)胞種類：微生物、植物或動物細(xì)胞轉(zhuǎn)化：在自然條件下，DNA很難進入細(xì)胞。為了大幅度提高DNA分子進入受體細(xì)胞的效率，通常需要對受體細(xì)胞進行特殊的處理的一操作。轉(zhuǎn)化的方法：物理方法（如電擊法）、化學(xué)方法（如氯化鈣法）、生物方法（如農(nóng)桿菌法）生物種類植物動物微生物常用方法農(nóng)桿菌法顯微注射法氯化鈣法受體細(xì)胞體細(xì)胞或受精卵受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程將目的基因插入（農(nóng)桿菌）Ti質(zhì)粒的T－DNA中（重組質(zhì)粒）→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上→表達將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→（顯微注射儀）顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細(xì)胞→細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)化成功的效率也只有104～102，因而需要高效篩選出接納了DNA分子的受體細(xì)胞。為了做到這一點，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞需要經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，使得用于篩選的性狀得以表達，這個過程稱為擴增。補充：1）轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實質(zhì)都是基因重組。2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入,第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T－DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入（非人工操作）是指含目的基因的T－DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。3）農(nóng)桿菌特點①能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。②農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T－DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。5．借助標(biāo)記基因篩選和鑒定含目的基因原因：只有少數(shù)細(xì)胞能接納DNA分子；進入受體細(xì)胞的DNA分子可能是空載質(zhì)粒；目的基因可能反向連入。需要借助有效的實驗技術(shù)快速、準(zhǔn)確地找到正確導(dǎo)入（甚至高效表達）目的基因的受體細(xì)胞，這一過程稱為篩選與鑒定。篩選含目的基因的受體細(xì)胞常用方法：抗藥性篩選法和顯色篩選法（1）抗藥性篩選抗藥性篩選法實施的前提條件：載體DNA攜帶抗生素的抗性基因標(biāo)記基因：可供篩選使用的功能性基因。第一輪篩選：篩選獲得的轉(zhuǎn)化成功克隆中有兩種類型：含重組質(zhì)粒的克隆和含空載質(zhì)粒的克隆。第二輪篩選：（2）顯色篩選經(jīng)抗藥性或顯色篩選獲得的含目的基因的受體細(xì)胞還需進一步鑒定安裝在載體上的目的基因位置是否正確以及是否能高效表達，這需要使用PCR技術(shù)和基因表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）的結(jié)構(gòu)和功能分析技術(shù)。實驗35PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳鑒定1.實驗原理：由于核苷酸的磷酸基團使DNA片段帶負(fù)電荷，所以電泳開始前應(yīng)將負(fù)電極插在凝膠板含DNA樣品的一端，將正電極插在另一端。通電后，DNA片段會通過凝膠向正極方向“泳動”。凝膠電泳主要根據(jù)核酸分子的大小和結(jié)構(gòu)將它們分離開來。2.實驗步驟：①按配方配制50×TAE電泳緩沖液。②將上述50×TAE電泳緩沖液稀釋50倍（即1×TAE），用1×TAE電泳緩沖液配制50mL濃度為0.7%（W/V）的瓊脂糖懸浮液，在微波爐中加熱至瓊脂糖溶解（溶液澄清）。③（配膠）待瓊脂糖溶液冷卻至50℃左右，倒入已放置了電泳梳的膠模板中，凝膠厚度為3~5mm。④待瓊脂糖凝膠完全凝固后，將凝膠連同膠模板一起放入盛有1×TAE電泳緩沖液的電泳槽中，使電泳緩沖液沒過凝膠約1mm，然后輕輕拔去電泳梳。⑤（點樣）將PCR擴增產(chǎn)物溶液（即DNA樣品）與5×上樣緩沖液按4∶1比例混勻后，用移液器取3~10μL（體積視DNA濃度而定）的上述混合液，緩緩加入瓊脂糖凝膠的樣品槽內(nèi)。⑥（電泳）蓋上電泳槽后通電，電壓為80~100V，使DNA向正極泳動。⑦（檢測）當(dāng)上樣緩沖液中的藍色染料（如核酸染料溴化乙錠（EB））泳動至瓊脂糖凝膠全長的三分之二時，切斷電源，取出凝膠和膠模板，在紫外燈（或核酸蛋白檢測儀）下觀察DNA電泳條帶。分析：標(biāo)準(zhǔn)樣：一直分子質(zhì)量的DAN樣品，作為對照。用來確定待測樣品中DNA的相對分子質(zhì)量。DNA熒光條帶：①條帶的有無：代表是否成功擴增出待測樣品中的DNA。若無條帶，常見原因有：無DNA模板，引物設(shè)計不合適。②條帶的亮度：代表擴增的DNA數(shù)量，越亮代表DNA數(shù)量越多③條帶的位置：常代表DNA的大小。一般距離點樣孔越遠(yuǎn)，說明跑的越快，DNA的分子質(zhì)量越小。4.構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動植物需要針對特定受體細(xì)胞進行操作如果構(gòu)建多細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因動植物，還需將表達載體導(dǎo)入可發(fā)育成動植物個體的受體細(xì)胞中。1.動物：動物的生殖細(xì)胞（精細(xì)胞和卵細(xì)胞）、受精卵（或早期胚胎細(xì)胞）、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞等方法：顯微注射或病毒感染（1）顯微注射：是動物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移普遍采用的一種物理轉(zhuǎn)化方法?；静僮鞒绦颍和ㄟ^激素療法使雌鼠超數(shù)排卵，并與雄性小鼠交配后從其輸卵管內(nèi)取出受精卵，用吸管將受精卵固定在倒置顯微鏡上，然后借助玻璃注射針向受精卵注入DNA溶液；將注射了DNA的受精卵移植到母鼠子宮中發(fā)育，繼而繁殖轉(zhuǎn)基因小鼠子代。病毒感染當(dāng)采用動物病毒（如腺相關(guān)病毒和慢病毒）DNA作表達載體時，可以通過病毒感染的方式高效導(dǎo)入動物細(xì)胞中。2.植物：植物的愈傷組織（或其他組織的原生質(zhì)體）、生殖細(xì)胞或胚胎組織等方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法或病毒感染轉(zhuǎn)基因動植物培育出來后，仍需要使用PCR等技術(shù)確認(rèn)轉(zhuǎn)基因是否獲得成功，以及目的基因在動植物體內(nèi)是否正確表達。三．構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動植物需要針對特定受體細(xì)胞進行操作1.蛋白質(zhì)工程在基因水平上設(shè)計和改造蛋白質(zhì)1.蛋白質(zhì)工程定義：由人為突變或設(shè)計基因進而操縱蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的過程操作流程，又稱稱第二代基因工程。2.蛋白質(zhì)工程包括修飾改造天然蛋白和設(shè)計制造全新蛋白兩個方面。修飾改造天然蛋白存在兩大類操作策略，即基因的定點突變（在DNA水平上改變蛋白質(zhì)特定位點的氨基酸序列）和定向進化（在DNA水平上隨機改變蛋白質(zhì)任一位點的氨基酸序列）。（1）修飾改造天然蛋白：兩大類操作策略：基因的定點突變和定向進化。一方面可實現(xiàn)氨基酸序列改造，優(yōu)化其功能；另一方面還可以確定多肽鏈中某個氨基酸殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能上的作用，以收集有關(guān)氨基酸殘基線性序列與其空間構(gòu)象和生物功能之間的對應(yīng)關(guān)系，為設(shè)計制作新型的突變蛋白提供理論依據(jù)。（2）設(shè)計制造全新蛋白：蛋白質(zhì)工程的另一關(guān)鍵方面是根據(jù)我們所掌揭的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能基本信息設(shè)計制造全新蛋白。設(shè)計制造全新蛋白需要根據(jù)已經(jīng)掌握的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，借助特器的電腦程序自行設(shè)計、拼裝感興趣的全新基因序列，然后借助重組DNA技術(shù)使之表達，進而檢測這種全新蛋白的性能是否能達到設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)。假設(shè)蛋白質(zhì)平均由200個氨基酸構(gòu)成，那么其氨基酸序列的可能性高達20200種，但自然界中天種全新蛋白的性能是否能達到設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)。然蛋白質(zhì)的氨基酸序列大約只有1012種。數(shù)十年來，人們采用定向突變和定向進化策略修飾改造的天然蛋白種類只是滄海一粟，而設(shè)計制造全新蛋白的理念就是在更廣泛的氨基酸序列海洋里開發(fā)自然界并不存在、但理論上可行的蛋白質(zhì)資源。2.蛋白質(zhì)工程根據(jù)人類需要改造目標(biāo)蛋白質(zhì)①定點突變方法：化學(xué)合成或PCR法人胰島素B鏈基因中編碼第28位脯氨酸和第29位賴氨酸的序列分別為CCC和AAG。因此，只需在人胰島素基因中將原來的“CCCAAG”序列改造成“AAGCCC”，理論上便能在受體細(xì)胞中產(chǎn)生兩處氨基酸序列顛倒的突變型人胰島素。由于人胰島素B鏈基因較短，按照設(shè)計好的編碼序列進行化學(xué)合成，是獲取這種突變型目的基因的首選方法。另外，也可采取PCR方案獲取突變型目的基因（PCR方案對較長的目的基因編碼序列更經(jīng)濟）。②定向進化：在體外對特定基因?qū)嵤╇S機突變，然后借助適當(dāng)?shù)暮Y選程序準(zhǔn)確、迅速地獲得所需要的突變基因。比如，針對某個特定的基因采用PCR技術(shù)進行擴增，在過程中通過改變反應(yīng)條件（如使用低保真度的DNA聚合酶）故意讓DNA復(fù)制發(fā)生隨機錯誤，便能創(chuàng)建一系列隨機突變的新基因序列；然后