免疫檢測(cè)技術(shù)課件

第九章免疫檢測(cè)技術(shù)免疫檢測(cè)是目前生物學(xué)檢測(cè)方法中用途最廣泛的一種方法。具有高度精確、靈敏、特異的特點(diǎn)。可用于免疫學(xué)的根底理論和應(yīng)用研究，也可應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。1、免疫疾病診斷2、動(dòng)物植物生理活動(dòng)研究〔激素、維生素〕3、物種及微生物鑒定4、動(dòng)物、植物性狀的免疫標(biāo)記5、免疫增強(qiáng)藥物和疫苗的研究6、發(fā)病機(jī)理研究7、分子生物學(xué)研究免疫檢測(cè)技術(shù)在生物科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用：第一節(jié)抗原抗體反響原理抗體能特異性地識(shí)別相應(yīng)的抗原，并與之結(jié)合。這種結(jié)合在體外也能發(fā)生，當(dāng)抗原和抗體在體外特異性結(jié)合后可出現(xiàn)肉眼可見或借助儀器可檢測(cè)出的反響現(xiàn)象。

試驗(yàn)時(shí)既可用抗體檢測(cè)標(biāo)本中有無相應(yīng)抗原，也可用抗原檢測(cè)標(biāo)本中有無相應(yīng)抗體。這種特性就是許多免疫檢測(cè)方法的根底!!一、體外抗原抗體反響的特點(diǎn)①特異性：抗原抗體反響具有高度的特異性。②可逆性：抗原抗體反響所形成的復(fù)合物較穩(wěn)定，但在一定條件下可解離?！驳退?、高鹽〕③比例性：抗原抗體的比例適宜，才可出現(xiàn)可見的反響現(xiàn)象。〔網(wǎng)格理論〕④階段性：特異性結(jié)合階段和可見反響階段。網(wǎng)格理論——解釋抗原抗體形成沉淀的機(jī)制三、抗原抗體反響類型1.沉淀反響2.凝集反響3.補(bǔ)體參與的反響4.中和反響5.免疫標(biāo)記技術(shù)第二節(jié)常見免疫檢測(cè)方法可溶性抗原〔血清蛋白、病毒抗原、細(xì)胞裂解液或組織液等〕與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下形成肉眼可見的沉淀物稱沉淀反響。一、免疫沉淀反響一、免疫沉淀反響

1.液相沉淀反響2.凝膠擴(kuò)散沉淀3.凝膠免疫電泳絮狀沉淀環(huán)狀沉淀免疫濁度沉淀單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)血清免疫電泳火箭電泳對(duì)流免疫電泳免疫印跡等絮狀沉淀試驗(yàn)操作步驟：〔1〕將可溶性抗原作一系列倍比稀釋?！?〕各管參加一定濃度的適量抗血清?！?〕振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育?！?〕產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。絮狀沉淀試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，設(shè)備要求低，敏感度較低，目前多用以測(cè)定抗原抗體反響的最適比。環(huán)狀沉淀試驗(yàn)操作步驟：〔1〕用毛細(xì)滴管吸取抗血清加于沉淀管〔5×50mm〕底部，防止產(chǎn)生氣泡。〔！〕〔2〕將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清晰的交界面?！泊郎y(cè)！〕〔3〕置沉淀管于室溫下使其反響，1~5min內(nèi)在兩界面間呈現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽性。30min仍無沉淀環(huán)出現(xiàn)那么為陰性。應(yīng)用：主要用于抗原的定性試驗(yàn)。用抗體來檢測(cè)未知抗原?！苍\斷炭疽的Ascoli實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌分型、血跡鑒定〕。2.凝膠擴(kuò)散沉淀凝膠擴(kuò)散沉淀是指抗原與抗體在凝膠介質(zhì)中自由擴(kuò)散形成濃度梯度，抗原與抗體在比例適宜的擴(kuò)散部位相遇形成沉淀線的反響。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。最常用的方法為：①單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)②雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)原理：將適當(dāng)濃度的抗體混入瓊脂凝膠中，瓊脂凝固后，打成小孔，參加待測(cè)的抗原物質(zhì)，使抗原在凝膠中由小孔自由向周圍擴(kuò)散，并在小孔周圍適宜的位置與抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關(guān)。單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)示意圖雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個(gè)小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料。當(dāng)抗原和抗體向四周凝膠中擴(kuò)散，在兩孔間可出現(xiàn)2～3條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測(cè)，或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析。3.免疫電泳技術(shù)免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反響的結(jié)合產(chǎn)物。這種技術(shù)有兩大優(yōu)點(diǎn)：一是加快了沉淀反響的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反響，以此作更細(xì)微的分析。免疫電泳包括:血清免疫電泳、對(duì)流免疫電泳、火箭電泳、免疫印跡等

血清免疫電泳將抗原混合物〔病人血清〕在凝膠中用電泳別離后，沿電泳方向挖一平行的小槽，參加抗血清，進(jìn)行雙向擴(kuò)散。沉淀線的特點(diǎn)顯示病人血清與正常人血清存在的差異，即血清蛋白組分的缺少或增加。免疫電泳原理圖解火箭免疫電泳火箭免疫電泳技術(shù)又稱作單向電泳擴(kuò)散免疫沉淀試驗(yàn)，它是由單向擴(kuò)散開展起來的一項(xiàng)定量技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是加速度的單向擴(kuò)散。

沉淀線的高度與抗原量成正比火箭電泳圖二、凝集反響〔Agglutination〕顆粒性抗原〔如細(xì)菌、細(xì)胞〕與相應(yīng)抗體，在適當(dāng)電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時(shí)間后出現(xiàn)肉眼可見凝集塊稱為凝集反響。1、直接凝集：將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反響，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒外表，與相應(yīng)抗體反響出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。妊娠免疫診斷試驗(yàn)

孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素〔HCG〕含量明顯增高?！睭CG是可溶性抗原〕反之，非孕婦尿中HCG含量甚微，缺乏以消耗掉抗HCG抗體。三、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)〔2個(gè)系統(tǒng)，5種成分〕抗原參加血清〔檢測(cè)抗體〕參加標(biāo)準(zhǔn)量補(bǔ)體參加包被抗體的紅細(xì)胞檢測(cè)紅細(xì)胞溶解情況AgYYPatient’sserum

YYYYYYYYAbNoAbAg三、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)〔2個(gè)系統(tǒng)，5種成分〕免疫標(biāo)記技術(shù)是采用酶、熒光素、放射性核素等標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體所進(jìn)行的抗原抗體反響。免疫標(biāo)記技術(shù)既可對(duì)樣品作定性、定量檢測(cè)，也可進(jìn)行定位分析，且大大提高了方法的靈敏度，是目前應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。四、免疫標(biāo)記技術(shù)常見標(biāo)記免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)

四、免疫標(biāo)記技術(shù)該法是用放射性核素作為標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體所進(jìn)行的抗原抗體反響，盡管放射免疫技術(shù)需特殊儀器設(shè)備且有一定的放射性危害，但由于其具有高度的靈敏度〔pg〕和自動(dòng)化檢測(cè)等特點(diǎn)，因此在實(shí)驗(yàn)研究和臨床檢測(cè)中仍被廣泛應(yīng)用。主要用于激素、小分子藥物、腫瘤標(biāo)志物等小分子化合物的定量分析。1.放射免疫技術(shù)〔125I〕放射免疫分析－根本原理競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反響的經(jīng)典標(biāo)記抗原〔Ag*〕和非標(biāo)記抗原〔Ag〕與限量抗體(Ab)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Ag*和Ag具有等同的與Ab結(jié)合能力

Ag*AbAg標(biāo)記抗原特異性抗體待測(cè)抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗體復(fù)合物分離Ag*-Ab和游離Ag*從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀知含量

測(cè)定Ag*-Ab和游離Ag*放射性

放射免疫測(cè)定法(RIA)示意圖RIA法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線

7550301001101001000未標(biāo)記抗原濃度〔ng/mL)結(jié)合/未結(jié)合的放射活性〔%〕Ag*-AbAg*將熒光素〔異硫氰酸熒光素或羅丹明等〕標(biāo)記抗體，制成熒光抗體診斷試劑。用熒光顯微鏡觀察熒光的產(chǎn)生或熒光強(qiáng)度，以此判斷抗原的存在、定位和分布情況。免疫熒光技術(shù)有直接法和間接法等。2.免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)——直接法AgY熒光素標(biāo)記的特異性抗體組織切片免疫熒光技術(shù)——間接法AgYY熒光素標(biāo)記的抗抗體組織切片待測(cè)抗體免疫熒光染色顯示細(xì)胞骨架

免疫熒光染色是利用抗原－抗體特異性結(jié)合的原理，用經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性或定量研究的方法。該技術(shù)與熒光顯微鏡觀察相結(jié)合，可對(duì)特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞或組織內(nèi)的精確定位。常用于抗原、抗體標(biāo)記的熒光染料有以下幾種顯示綠色熒光：Fluoresceinisothocyancie(FITC),Alexa-488顯示紅色熒光：RhodamineB,TexasRed,Alexa-546,568,594顯示藍(lán)色熒光：Alexa－350用Alexa488標(biāo)記的抗人α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細(xì)胞核:紅色,DAPI染色人皮膚角化細(xì)胞免疫熒光染色用抗α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細(xì)胞核:紅色,DAPI染色(激光共聚焦顯微鏡照片)PtK1細(xì)胞免疫熒光染色本法是抗原抗體反響的特異性與酶對(duì)底物的高效催化活性相結(jié)合的免疫檢測(cè)技術(shù)。酶標(biāo)記的抗原或抗體與待檢標(biāo)本中的相應(yīng)成分特異性結(jié)合，根據(jù)酶作用底物后的顏色變化，采用肉眼或酶標(biāo)檢測(cè)儀分析、判斷結(jié)果。常用方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和酶免疫組化法，前者用于檢測(cè)可溶性抗原或抗體，后者常用于檢測(cè)組織中或細(xì)胞外表的抗原。3.免疫酶測(cè)定法是在固相載體〔通常為聚苯乙烯反響板〕外表進(jìn)行的抗原抗體反響。實(shí)驗(yàn)中常用的酶是辣根過氧化物酶〔HRP〕，底物為二苯基聯(lián)苯胺。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)〔ELISA〕：ELISA試驗(yàn)三個(gè)必要的試劑(1)固相的抗原或抗體〔免疫吸附劑〕(2)酶標(biāo)記的抗原或抗體〔標(biāo)記物〕(3)酶作用的底物〔顯色劑〕底物顯色定性或定量的分析原理包被反響參加待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的別離1234根本步驟五種常見的檢測(cè)方法1雙抗夾心法〔測(cè)定抗原〕2測(cè)定抗體的間接法3競(jìng)爭(zhēng)法〔測(cè)定抗原〕4捕獲包被法測(cè)IgM抗體5ABS-ELISA法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及低于二價(jià)的小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心

1雙抗夾心法測(cè)抗原2間接法測(cè)抗體幾種標(biāo)記/檢測(cè)技術(shù)靈敏度的比較酶標(biāo)熒光放免發(fā)光靈敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9幾種標(biāo)記/檢測(cè)試劑的有效期比較酶標(biāo)熒光放免發(fā)光有效期〔月〕1815129630020,00040,00060,00080,000100,000試劑盒儀器特殊防護(hù)治理污染人民幣人民幣三種免疫測(cè)定技術(shù)的本錢及費(fèi)用三種免疫測(cè)定技術(shù)的本錢及費(fèi)用放免酶標(biāo)發(fā)光A.

將Ab吸附在固相載體外表;B.參加酶標(biāo)Ag和待測(cè)Ag，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Ab；對(duì)照只參加酶標(biāo)Ag；C.加底物。對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知Ag量。3競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原血清標(biāo)本中的IgM包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM參加特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合抗人IgM抗體包被參加血清標(biāo)本參加特異性抗原試劑參加針對(duì)特異性抗原的酶標(biāo)抗體加底物顯色4捕獲包被法測(cè)IgM抗體捕獲法

原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕獲待測(cè)標(biāo)本中IgM類抗體參加特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體底物顯色ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語