uplc法測(cè)定姜中姜酚類成分的含量

uplc法測(cè)定姜中姜酚類成分的含量

生姜是姜科植物的一種干燥的葉子。它具有加熱和散寒、回陽(yáng)通脈、除濕和排泄粘液的功效。姜酚(gingerol)是干姜中的辣味物質(zhì),也是干姜的主要有效部位之一,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí),姜酚具有抗氧化,抗?jié)?刺激血液循環(huán),抗癌防衰等多種藥理作用。姜酚的種類有十多種,其中含量較高的為6姜酚、8姜酚、10姜酚。由于姜酚類化合物化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,易受酸、堿、熱等因素影響,給姜酚的提取分離和含量測(cè)定帶來(lái)了較大難度,因此對(duì)干姜總酚的提取工藝進(jìn)行系統(tǒng)考察具有一定的理論和實(shí)際意義。干姜姜酚的提取工藝前人已有報(bào)道,但多只以干姜中某一種姜酚類成分為指標(biāo),多指標(biāo)的提取工藝優(yōu)選實(shí)驗(yàn)尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以6、8、10姜酚的總含量為指標(biāo),比較不同提取方法和不同提取溶劑對(duì)姜酚類成分的提取效果,并進(jìn)一步采用正交設(shè)計(jì)法考察姜酚類成分的最佳提取工藝,以期為干姜的進(jìn)一步利用和開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1儀器和試劑盒1.1超聲清洗器、粉碎機(jī)WatersAcquityH-ClassUPLC超高效液相色譜儀,包括四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器以及Empower2工作站(美國(guó)Waters公司);KQ3200DB型超聲清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司);DZF6050型真空干燥箱(上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠);SQ2119B型多功能食品粉碎機(jī)(上海帥佳電子科技有限公司);滲濾裝置(自制)。1.2姜酚質(zhì)量分析姜酚對(duì)照品批號(hào)分別為:6姜酚(23513-146)、8姜酚(23513-088)和10姜酚(23513-157)購(gòu)于鼎瑞化工(上海)有限公司,經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、MS、IR和UV等光譜檢測(cè)確認(rèn)其結(jié)構(gòu),按本方法色譜條件,歸一化法測(cè)得6、8、10姜酚純度分別為98.79%、98.81%和99.13%。干姜樣品(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥庫(kù)房提供,經(jīng)本文通訊作者鑒定為姜科植物姜(ZingiberofficinaleRosc.)的根莖,粉碎后過(guò)40目篩備用);乙腈為色譜純(美國(guó)TEDIA公司);乙醇、醋酸等試劑均為分析純;屈臣氏蒸餾水;0.2μm微孔濾膜(上海陸納生物科技有限公司)。2方法和結(jié)果2.1流動(dòng)相及色譜柱WatersAcquityH-ClassUPLC超高效液相色譜儀,包括四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器以及Empower2工作站(美國(guó)Waters公司);色譜柱:AcquityBEHC18(2.1mm×50mm,1.8μm);流動(dòng)相:乙腈-0.1%醋酸水溶液,梯度洗脫程序:0~1.0min,50∶50;1~2.5,50∶65;2.5~4.0,65~70;4.0~6.0,70~100;6.0~8.5,100∶0;8.5~9.0,50∶50(v∶v);流速為0.30mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm;柱溫:30℃。在上述色譜條件下6、8、10姜酚的分離度較好,6、8、10姜酚混合對(duì)照品、及干姜樣品UP-LC色譜圖見圖1。2.2溶液的制備2.2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液分別精密稱取6、8、10姜酚對(duì)照品各10mg左右,置50mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,作為對(duì)照品儲(chǔ)備液;分別取對(duì)照品儲(chǔ)備液各1.0mL置10mL容量瓶中,作為對(duì)照品稀釋液;再分別取對(duì)照品稀釋液2.5、0.5、1.0mL,置于同一10mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,得質(zhì)量濃度為0.08905、0.01382、0.0342mg·mL-1的6、8、10姜酚的混合對(duì)照品溶液。2.2.2不同溶劑對(duì)干法提取液中控制液干性率的影響取干姜粗粉10g,分別加入10倍量的水,50%乙醇,70%乙醇,95%乙醇和甲醇,采用超聲法對(duì)樣品處理得到干姜提取液,取干姜提取液1.0mL至10mL容量瓶中,定容即得干姜樣品溶液。2.3方法研究2.3.1線性關(guān)系的考察結(jié)果表明6、8、10姜酚分別在0.0891~0.5343μg,0.0138~0.0829μg,0.0342~0.2052μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。2.3.2儀器精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液各1μL,自動(dòng)進(jìn)樣6次,按“2.1”所述色譜條件測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算6、8、10姜酚的RSD%(n=6)分別為0.52%,0.76%,0.57%,表明儀器精密度良好。2.3.3溶液穩(wěn)定性測(cè)定精密吸取同一樣品溶液分別在第0,2,4,8,12,24h進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果6、8、10姜酚的峰面積RSD%(n=6)分別為0.31%,0.86%,0.97%,表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)按“2.2.2項(xiàng)下”方法,以95%乙醇為溶劑,制備取6份樣品,各精密吸取1μL,自動(dòng)進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果6、8、10姜酚的峰面積RSD%(n=6)分別為0.34%,1.66%,0.49%,表明重復(fù)性良好。2.3.5加樣回收率試驗(yàn)取已知姜酚含量的干姜(6、8、10姜酚分別為2.347、0.803、0.787mg·g-1)樣品粉末6份,每份0.4g左右,精密稱定,置于10mL具容量瓶中,分別加入濃度為0.891mg·mL-1的6姜酚溶液1.0mL、0.138mg·mL-1的8姜酚溶液1.5mL、0.342mg·mL-1的10姜酚1.0mL,按“2.2.2項(xiàng)下”超聲法制備供試品溶液,進(jìn)樣1μL,按“2.1項(xiàng)下”色譜條件測(cè)定,并計(jì)算回收率,6、8、10姜酚的平均回收率分別為98.12%、98.64%和97.85%,RSD%分別為2.18%、1.86%和1.76%,具體結(jié)果見表2。3姜酚類物質(zhì)的提取3.1提取溶媒、提取溶劑、提取時(shí)間根據(jù)姜酚類成分的理化性質(zhì),分別以10倍量水,50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇,甲醇為提取溶媒,以超聲法為提取方法,對(duì)提取溶媒進(jìn)行考察,超聲處理時(shí)間為30min。見表3。結(jié)果表明,提取率最高的溶媒為甲醇,95%乙醇與甲醇在提取率上相比有一定的差距,但考慮甲醇有一定的毒性,不適用于工業(yè)化生產(chǎn),故實(shí)驗(yàn)選擇95%乙醇為其提取溶媒進(jìn)一步進(jìn)行考察。3.2提取方法的比較根據(jù)姜酚類成分對(duì)熱不穩(wěn)定的特點(diǎn),本文沒(méi)有采用回流提取、索式提取等加熱提取方法,而是對(duì)超聲提取法,冷浸法和滲漉法等冷提方法提取姜酚類成分的效果進(jìn)行了比較,結(jié)果見表4。結(jié)果表明,姜酚類成分收率為:滲漉>超聲>冷浸。3.3工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)根據(jù)表4中結(jié)果,超聲提取與滲漉提取相比,雖然時(shí)間短,但姜酚得率較低,且超聲提取對(duì)設(shè)備要求高,能耗大,難以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn);而滲漉法可以節(jié)約能源,對(duì)設(shè)備要求低,操作簡(jiǎn)便,轉(zhuǎn)移率高,更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。根據(jù)溶劑和提取方法結(jié)果綜合分析,采用正交設(shè)計(jì)法,對(duì)乙醇濃度,滲漉乙醇用量以及滲漉流速3個(gè)主要因素對(duì)姜酚類成分的提取工藝影響進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)選,具體因素水平的設(shè)計(jì)詳見表5。精確稱取干姜粗粉10g,裝入自制滲漉筒中,裝完后先向筒內(nèi)加入4倍量各濃度的乙醇溶液加蓋冷浸2h后再按L9(34)設(shè)定具體工作安排表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測(cè)定并計(jì)算6、8、10姜酚總收率和干姜浸膏總重量。結(jié)果用極差法以及方差法進(jìn)行分析詳見表6、表7、表8。由表6結(jié)果可見,根據(jù)極差R的大小,在6、8、10姜酚總收率中其影響因素順序?yàn)锳>C>B,即乙醇濃度>滲漉流速>乙醇用量;在干姜浸膏總重量中其影響因素順序?yàn)锳>B>C,即乙醇濃度>乙醇用量>滲漉流速。由直觀分析得,對(duì)于6、8、10姜酚總收率最佳工藝為A2B1C3,即乙醇濃度為80%,乙醇用量為8倍、滲漉流速為20mL/(kg·min);對(duì)于干姜浸膏總重量最佳工藝為A1B3C1,即乙醇濃度為70%,乙醇用量為12倍,流速為5mL/(kg·min)。由表7,表8進(jìn)行方差分析可知,在6、8、10姜酚總收率中乙醇濃度、乙醇用量和滲漉流速3種因素均無(wú)顯著性,在干姜浸膏總重量中乙醇濃度和乙醇用量有顯著性,而在前面考察溶媒時(shí)未使用80%乙醇,且70%乙醇提取率低于95%乙醇,綜合極差的直觀分析,工藝選擇為12倍量的80%乙醇滲漉。由于滲漉流速都沒(méi)有顯著性,在極差分析中,滲漉流速這一因素在在干姜浸膏得率中的影響大于6、8、10姜酚總含量的影響,考慮到干姜浸膏中尚含有其他數(shù)種姜酚類成分,故可選擇5mL/(kg·min)為其最佳滲漉流速。綜上所述,篩選可得最佳乙醇滲漉工藝為A2B3C1,即藥材粗粉裝入滲漉筒中,裝完后先向筒內(nèi)加入4倍量80%的乙醇溶液,冷浸2h后,再加入剩余量80%乙醇按5mL/(kg·min)的速度滲漉,收集滲漉液即得。3.4姜酚含量測(cè)定采用正交設(shè)計(jì)確定的最佳條件進(jìn)行了3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),即以10g干姜藥材,按最佳滲漉條件提取,收集滲漉液,按“2.1項(xiàng)下”色譜條件測(cè)定得6、8、10姜酚總含量分別為3.933、3.974、3.967mg·g-1;浸膏得率分別為11.58%、11.76%和11.88%。4最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀分析和方差分析表明各因素對(duì)姜酚類成分滲漉提取的影響大小依次為乙醇濃度>乙醇用量>滲漉流速,其中乙醇濃度對(duì)提取量有顯著影響。綜合分析得出干姜滲漉法提取的最佳工藝為:藥材粗粉,用12倍量80%乙醇滲漉,先加4倍量的80%乙醇溶液,冷浸2h后,再加入剩余量乙醇按5mL/(kg·min)的速度滲漉,收集滲漉液即得。按最佳工藝條件進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果表明該最佳工藝具有良好的重復(fù)性。超高效液相色譜(UPLC)法與高效液相色譜法(HPLC)比較具有分析時(shí)間快、靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn),在中藥質(zhì)量控制和指紋圖譜建立等研究中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。實(shí)驗(yàn)比較了AcquityBEHC18(2.1mm×100mm,1.7μm)、AcquityBEHC18(2.1mm×50mm,1.7μm)和AcquityHSST3(2.1mm×50mm,1.8μm)3種色譜柱和柱溫、流速等實(shí)驗(yàn)因素,經(jīng)優(yōu)化得到本實(shí)驗(yàn)的色譜條件。同時(shí),考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸和乙腈-0.1%磷酸水4個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)的