姜類藥材中3種藥用姜中4種姜酚含量測定

姜類藥材中3種藥用姜中4種姜酚含量測定

生姜、生姜和生姜是生姜科的一種生姜。根及其加工產(chǎn)品對生姜的治療效果不同，對中醫(yī)的臨床應用也有一定的不同?，F(xiàn)代藥理研究表明,姜具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤、抗病原體、保肝利膽、抗?jié)?、改善心血管系統(tǒng)等多種藥理作用[1~3]。姜的主要成分為揮發(fā)油和無揮發(fā)性的姜辣素類化合物,2類化合物在組方入藥的過程中均能產(chǎn)生藥理作用。以6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚為代表的姜辣素類化合物是姜的特征性化學成分之一,研究證實姜酚具有強心、調(diào)節(jié)血管舒縮功能、抗血小板、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗氧化與保護心肌等藥理作用。目前,姜酚類成分的含量測定方法以高效液相色譜(HPLC)法為主,但以往的方法大多采用含酸的流動相體系,易使姜酚脫水形成姜烯酚,降低測定結果的準確性。另外,部分方法的前處理過程需要柱層析分離等步驟,較為煩瑣[6~8]。本試驗采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法,可以在20min內(nèi)快速測定干姜、炮姜和生姜中6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的含量,方法簡便、準確、高效,能夠為藥用姜的加工炮制和質(zhì)量控制提供參考和依據(jù)。1材料、藥品和標準品Agilent1200型HPLC儀(美國安捷倫公司);AW120型電子天平(日本島津公司);ZN-100微型高速粉碎機(中南制藥機械廠);BRANSON5510E超聲儀(美國必能信公司)。干姜(北京同仁堂飲片廠,批號:100520)、炮姜(北京同仁堂飲片廠,批號:100429)、生姜(購自農(nóng)貿(mào)市場),經(jīng)山西省藥品檢驗所鑒定均為姜科植物姜Z.officinaleRosc.的根莖及加工品;6-姜酚(批號:E-0128)、8-姜酚(批號:E-0165)、10-姜酚(批號:E-0135)標準品(上海同田生物技術有限公司,經(jīng)HPLC面積歸一化法檢查純度均>98.5%);乙腈、甲醇為色譜純,水為重蒸餾水,其他試劑均為分析純。2方法和結果2.1流動相及色譜條件色譜柱:依利特HypersilODS2(250mm×4.6mm,5μm);流動相:乙腈-水(72∶28);流速:1mL·min-1;檢測波長:280nm;柱溫:25℃;進樣量:10μL。在此色譜條件下,6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚與樣品中其他組分的色譜峰分離完全。色譜見圖1。2.2標準品貯備液的制備精密稱取6-姜酚標準品11.56mg、8-姜酚標準品10.72mg和10-姜酚標準品10.31mg,分別置于10mL量瓶中,用甲醇定容,搖勻,即得標準品貯備液(6-姜酚為1.156mg·mL-1、8-姜酚為1.072mg·mL-1、10-姜酚為1.031mg·mL-1),置4℃冰箱貯藏,備用。2.3超聲用量的確定干姜和炮姜粉碎后過4號篩,分別精密稱取約0.15g;生姜適量切成碎末,用濾紙擦干表面汁液,精密稱取約0.15g,分別置于10mL量瓶中,加甲醇45mL超聲(功率:100W,頻率:40kHz)處理20min,放冷至室溫,加甲醇至刻度,搖勻,過0.45μm濾膜,取續(xù)濾液,即得。2.4回歸方程的制備分別精密吸取“2.2”項下標準品貯備液0.1、0.5、1、10、20mL,置于100mL容量瓶中,加甲醇稀釋,搖勻,按上述色譜條件分別進樣10μL(每份重復進樣3次),測定峰面積。以標準品濃度(X,μg·mL-1)為橫坐標,峰面積積分值(Y)為縱坐標,制備標準曲線,得6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的回歸方程分別為Y=1.1377X+0.1265(r=0.9999,n=5)、Y=1.1126X+0.1343(r=0.9998,n=5)、Y=1.0968X+0.1564(r=0.9999,n=5)。結果表明,6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的進樣濃度分別在1.156～231.200、1.072～214.400、1.031～206.200μg·mL-1范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關系。2.5日性關系考察結果分別取3種姜酚低、中、高3種濃度標準品溶液,連續(xù)進樣3次,考察方法的日內(nèi)精密度。結果,6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面積的RSD分別為0.25%、0.42%、0.52%(n=9);再連續(xù)3d進樣,考察方法的日間精密度。結果,6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面積的RSD分別為0.36%、0.63%、0.73%(n=9),表明方法的精密度良好。2.6峰面積的測定精密稱取干姜粉末適量,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,分別于0、1、3、6、12、24h測定6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的峰面積。結果,3種姜酚峰面積的RSD分別為0.89%、1.13%、1.05%(n=6),表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.7制備供試品溶液精密稱取干姜粉末適量,共6份,分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液,測定3種姜酚的含量。結果,6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚含量的RSD分別為0.55%、0.82%、0.49%(n=6),表明方法重復性良好。2.8加樣回收率試驗精密稱取已知3種姜酚含量的干姜樣品粉末適量,共6份,精密加入適量3種姜酚標準品貯備液,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件進行測定,計算加樣回收率,結果見表1。2.9樣品含量的測量精密稱取干姜、炮姜和生姜樣品粉末適量,分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按上述方法測定3種姜酚的含量,結果見表2。3提取方法的確定本試驗對超聲和回流等提取方法進行了比較,發(fā)現(xiàn)超聲提取的3種姜酚成分含量要高于回流提取,分析其原因為加熱回流提取會使姜酚類成分發(fā)生脫水轉(zhuǎn)變,導致含量降低。另外,分別采用50%、75%和純甲醇作為提取溶劑,發(fā)現(xiàn)純甲醇對此類成分具有更高的提取效率。通過對超聲提取時間的考察,發(fā)現(xiàn)到20min后3種姜酚的含量不再增加,可保證提取完全。故最終選擇樣品提取方法為加甲醇45mL超聲處理20min。選擇230nm和280nm特征波長進行比較,發(fā)現(xiàn)230nm處于吸收曲線的肩峰位置,易受到干擾;選擇280nm作為檢測波長,色譜圖峰形較好、靈敏度高。同時,本試驗比較了甲醇-水和乙腈-水流動相體系,從保留時間和分離度進行分析,結果發(fā)現(xiàn)乙腈-水體系的分離效果更好,3種姜酚的色譜峰與相鄰色譜峰均可