目的基因的獲得及分離方法

目的基因的獲得及分離方法11.目的基因的分離方法

根據(jù)不同類型基因組的大小、基因組成和基因排列方式不同，采用以下的方法可以把目的基因從基因組中分離出來。直接分離法基因文庫的篩選法聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）法染色體步移染色體跳躍法化學(xué)合成法基因分離克隆的新技術(shù)1.1直接分離法

（1）物理化學(xué)法（2）限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法（3）逆轉(zhuǎn)錄法（1）物理化學(xué)法

根據(jù)基因片段的堿基組成差異較大，其理化性質(zhì)，如浮力密度和解鏈溫度等的差異，從生物基因組中分離目的基因。密度梯度離心法單鏈酶解法分子雜交法11/11/20235密度梯度離心法

根據(jù)液體在離心時其密度隨轉(zhuǎn)軸距離而增加，堿基GC配對的雙鏈DNA片段密度較大，利用精密的密度梯度超離心技術(shù)可使切割適當片段的不同DNA按密度大小分布開來，進而通過與某種放射性標記的mRNA雜交來檢驗，分離相應(yīng)的基因。11/11/2023611/11/20237單鏈酶解法

堿基GC配對之間有三個氫鍵，比AT配對的穩(wěn)定性高。當用加熱或其他變性試劑處理DNA時，雙鏈上AT配對較多的部位先變成單鏈，應(yīng)用單鏈特異的S1核酸酶切除單鏈，再經(jīng)氯化銫超速離心，獲得無單鏈切口的DNA11/11/20238分子雜交法

單鏈DNA與其互補的序列總有“配對成雙”的傾向，如DNA：DNA配對或者DNA：RNA配對，這就是分子雜交的原理。利用分子雜交的基本原理既可以分離又可以鑒別某一基因。

（2）限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法對已知序列的DNA分子；對已知定位的目的基因；對已知酶切位點；

缺點：該方法適于從基因組簡單的生物體中分離目的基因，如病毒等。11/11/20239（3）逆轉(zhuǎn)錄法

即利用逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成相應(yīng)的DNA方法。主要用于合成分子量較大而又不知其序列的基因。11/11/202310（3）逆轉(zhuǎn)錄法

這種方法是以目的基因的mRNA為模板，借助逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補的DNA(cDNA)，再在DNA聚合酶的催化下合成雙鏈cDNA片段，與適當?shù)妮d體結(jié)合后轉(zhuǎn)入受體菌，擴增為cDNA文庫。然后，采用適當?shù)姆椒◤腸DNA文庫中篩選出目的基因。11/11/2023111.2基因文庫篩選法

（1）鳥槍法

（2）基因組文庫法（3）cDNA文庫法鳥槍法

1.使用限制性核酸內(nèi)切酶（簡稱限制酶）將帶有目的基因的DNA鏈切成若干小段。2.再使用DNA連接酶將其整合到載體的基因中,并使其表達。3.如果在某個細胞中得到了目的產(chǎn)物,就說明整合到該細胞中的DNA片段就是所需要的DNA片段。基因組文庫法

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。如果這個文庫包含了某種生物的所有基因，那么，這種基因文庫叫做基因組文庫。cDNA文庫法

以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個細菌含有一段cDNA，并能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。cDNA文庫法

cDNA文庫特異地反映某種組織或細胞中，在特定發(fā)育階段表達的蛋白質(zhì)的編碼基因，因此cDNA文庫具有組織或細胞特異性。1.3聚合酶鏈式反應(yīng)法（PCR）

PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于目的基因的擴增與分離。若已知目的基因的全序列或其兩側(cè)序列，可通過合成一對與模板DNA互補的引物，十分有效地擴增出所需的目的基因。18由1983年美國Mullis首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。到如今2013年，PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。1973年，臺灣科學(xué)家錢嘉韻，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的TaqDNA聚合酶，為PCR技術(shù)發(fā)展也做出了基礎(chǔ)性貢獻。19PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。20無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。11/11/2023211.3聚合酶鏈式反應(yīng)法（PCR）PCR(聚合酶鏈式反應(yīng)）是利用DNA在體外95℃高溫時變性會變成單鏈，低溫（經(jīng)常是50°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實際就是一個溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。11/11/2023231.4染色體步移

先根據(jù)遺傳學(xué)分析確定目的基因所在染色體的大致位置，然后應(yīng)用與之連鎖的遺傳標記作為分子探針，從基因文庫中篩選出與此標記5`端和3`端部分重疊的DNA克隆，再以篩選到的DNA克隆去篩選與他們臨近的DNA克隆。11/11/2023251.5染色體跳躍

如果將染色體的DNA用識別序列長的限制性內(nèi)切酶切割成較大的片段（百萬堿基），這樣克隆后獲得的基因組文庫為染色體跳躍文庫。建立跳躍文庫歷經(jīng)二次限制性內(nèi)切酶切割，一次片段大，一次片段小。1.6基因的化學(xué)合成

已知核苷酸序列：磷酸二酯鍵

化學(xué)合成法：氨基酸序列→基因序列→合成目的基因除了相關(guān)基因片段，還可以合成PCR引物、基因序列分析引物、核酸分子雜交的引物、基因定點誘變序列。1.7基因分離克隆的新技術(shù)基因表達序列標記分析代表性差異分析抑制差減雜交2、目的基因的分離策略基因數(shù)量較大，直接分離不容易，需要一定的策略（1）已知目的基因的部分序列或其他物種同源基因的保守序列①PCR②探針基因文庫2、目的基因的分離策略

（2）已知基因表達的蛋白產(chǎn)物①②2、目的基因的分離策略

（3）定位克隆通過遺傳學(xué)的分析，可以將某個基因定位到染色體的具體位置，然后進行染色體步移不斷縮小篩選區(qū)域，最后將該基因克隆出來。前提：構(gòu)建完整的基因組文庫，大量的測序工作。應(yīng)用：編碼產(chǎn)物的未知基因。2、目的基因的分離策略

（4）表型克隆既不了解生物體內(nèi)某個基因的產(chǎn)物，也沒有對它們進行基因定位，但是知道該生物在表型上存在差異，那么可以利用表型差異或組織器官特異表達產(chǎn)生差異來克隆植物基因。2、目的基因的分離策略

（5）差異顯示技術(shù)分離基因生物體內(nèi)所有的生理和病理變化，最終都是通過基因表達的差異體現(xiàn)出來。方案：通過比較不同組織中基因表達，將表達差異不同的基因分離出來，從而為克隆復(fù)雜形狀相關(guān)基因開辟了重要途徑。2、目的基因的分離策略

（5）差異顯示技術(shù)分離基因基本程序：提取兩種細胞mRNA，反轉(zhuǎn)錄后成為兩種cDNA采用隨機引物進行PCR。通過擴增產(chǎn)物的電泳分析，分離出不同樣品間的差一條帶。④將差異DNA做成探針。⑤在cDNA文庫或基因組文庫中篩選基因并做功能分析。2、目的基因的分離策略

（6）基因芯片技術(shù)和電子克隆通過基因芯片將不同組織中表達有差異的基因全部分離出來，然后通過數(shù)據(jù)庫得到這些基因的序列，并進一步得到全長基因和功能分析。電子克?。夯虼笠?guī)模測序為基因表達序列標簽（EST）庫提供充分的數(shù)據(jù)，代表某個組織中表達的全部基因及其數(shù)量。2、目的基因的分離策略

（7）大規(guī)模測序與功能基因分析大量生物的全基因組測序已完成，其功能基因序列、定位和注釋為目的基因的分離提供了強大而系統(tǒng)的數(shù)據(jù)來源。DNA序列測定

目的基因測序的目的：比較該基因的序列與已知序列的同源性或者對新的基因進行登記。測序：ATCG排列順序測序常用來對轉(zhuǎn)化子進行序列分析，其結(jié)果是最直接最客觀反應(yīng)轉(zhuǎn)化子中有無目的基因的方法。DNA序列測定

（1）化學(xué)降解法化學(xué)試劑切割DNA鏈的過程包括堿基的修飾、修飾的堿基從糖環(huán)上脫離下來、失去堿基的糖環(huán)部位發(fā)生DNA鏈的斷裂DNA序列測定

2、酶促法又稱為sanger法或者雙脫氧鏈終止法。三、基因的突變和修飾體外誘變：對克隆化基因進行誘變處理，改變其核苷酸序列，獲得突變基因以用于研究基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)，它在基因工程和蛋白質(zhì)工程應(yīng)用中發(fā)揮了重要作用。三、基因的突變和修飾

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