仔豬副傷寒活疫苗

仔豬副傷寒活疫苗（C500株）生產(chǎn)操作細(xì)則本品系使用免疫原性良好的豬霍亂沙門氏菌弱毒株，接種適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)，收獲培養(yǎng)物加入適當(dāng)穩(wěn)定劑，經(jīng)真空冷凍干燥制成。本品用于預(yù)防仔豬副傷寒活疫苗。1、菌種1.1疫苗生產(chǎn)用菌種為豬霍亂沙門氏菌C500弱毒株，原種購(gòu)于中國(guó)獸藥檢查所，經(jīng)擴(kuò)繁后由質(zhì)檢部鑒定、保管、供應(yīng)。1.2菌種標(biāo)準(zhǔn)1.2.1C500弱毒株應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn)1.2.1.1形態(tài)和生化特性本菌為革蘭氏陰性小桿菌，生化特性應(yīng)符合細(xì)菌分類學(xué)中本菌的特性。1.2.1.2培養(yǎng)特性在普通瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18-22小時(shí)，菌落為圓形、邊緣整齊、突起、半透明、略濕潤(rùn)的光滑型。1.2.1.3血清學(xué)特性普通瓊脂新鮮培養(yǎng)物用玻片凝集檢查法，對(duì)沙門氏菌屬O7因子血清出現(xiàn)凝集反應(yīng)。1.2.1.4特異性在含1%的醋酸鉈的普通肉湯中呈均勻渾濁生長(zhǎng)，用新鮮普通瓊脂培養(yǎng)物與1\500%吖啶黃溶液做玻片凝集試驗(yàn)應(yīng)不出現(xiàn)凝集反應(yīng)。1.2.1.5安全性用pH7.4-7.6的普通肉湯或蛋白胨水，將培養(yǎng)24-48小時(shí)的普通瓊脂斜面培養(yǎng)物洗下并作活菌計(jì)數(shù)，注射下列動(dòng)物應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)。小白鼠18-22g（30-35日齡）的小白鼠10只，各皮下注射0.2ml，含活菌數(shù)1億，觀察21日，至少應(yīng)存活9只。家兔體重1.5-2.0kg的家兔5只，各皮下注射1ml，含活菌數(shù)100億，觀察21日應(yīng)存活。仔豬用體重15kg以上的健康易感斷奶仔豬4頭，各靜脈注射1ml，含活菌數(shù)30億，觀察1個(gè)月應(yīng)存活。1.3凍干菌種2-8℃保存期為10年。2、疫苗制造及半成品檢驗(yàn)2.1生產(chǎn)用菌種的制備2.1.1一級(jí)種子繁殖和鑒定凍干種子用普通肉湯稀釋或經(jīng)普通肉湯后，接種普通瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18-20小時(shí)，觀察菌落形態(tài)，菌落為圓形、邊緣整齊、突起、半透明、略濕潤(rùn)的光滑型。選取中等偏大的菌落5-10個(gè)，混合后接種于普通瓊脂斜面若干只，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格，并用0.2%吖啶黃溶液做玻片凝集試驗(yàn)應(yīng)合格，作為一級(jí)種子。在2-8℃保存期不超過1個(gè)月，在此期間可以移植1-2次，在培養(yǎng)基上繼代不超過5代。2.1.2二級(jí)種子繁殖取一級(jí)種子接種于普通瓊脂或普通肉湯，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，即可作為生產(chǎn)種子，在2-8℃保存期不超過2日。2.2制苗用培養(yǎng)基制備2.2.1材料牛肉要求應(yīng)采購(gòu)新鮮的精牛肉，3-5歲，前后腿、胸部，盡量少含脂肪、肌腱、筋膜等。魚蛋白胨1.5%胰蛋白胨0.5%氯化鈉0.5%氫氧化鈉水2.2.2制備方法將新鮮的精牛肉去掉脂肪、筋膜等絞碎，純化水低溫浸泡24小時(shí)，100℃煮沸2小時(shí)，補(bǔ)足失去的水分，冷卻靜止沉淀24小時(shí)，抽取上清液，加入魚蛋白胨、胰蛋白胨、氯化鈉溶化，用氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值至7.8，煮沸20分鐘，降溫靜止沉淀。3.1條件準(zhǔn)備3.1.1根據(jù)菌液制備所需物品及設(shè)備條件，進(jìn)行全面準(zhǔn)備。3.1.2按使用時(shí)間，提前做好對(duì)發(fā)酵罐空消工作，包括罐體、空氣過濾系統(tǒng)、各個(gè)進(jìn)出料口，確保滅菌無死角。將準(zhǔn)備好的各種物品提前移入潔凈工作間待用。3.1.3在工作開始前30～40min，按凈化級(jí)別要求調(diào)整送風(fēng)量，達(dá)到潔凈級(jí)別要求。3.1.4提前一天對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行全面滅菌，并保持發(fā)酵罐正壓。3.2進(jìn)料及培養(yǎng)基滅菌

將配制好的培養(yǎng)基通過管道打入發(fā)酵罐，加入消泡劑（豬油），然后對(duì)進(jìn)料管道進(jìn)行清洗、滅菌，關(guān)閉進(jìn)料閥門，對(duì)培養(yǎng)基及所有的進(jìn)出口、空氣過濾系統(tǒng)進(jìn)行滅菌，當(dāng)溫度達(dá)到90℃和100℃時(shí)，分別經(jīng)上面空氣進(jìn)管和下面放料口向罐內(nèi)通入蒸汽1分鐘左右，罐內(nèi)116℃保持40分鐘，其他位置121℃保持40分鐘。滅菌結(jié)束后馬上夾層通冷水進(jìn)行降溫并及時(shí)補(bǔ)充無菌空氣保持罐內(nèi)正壓。當(dāng)溫度降至40℃時(shí)，關(guān)閉冷水管道停止降溫，通無菌空氣保持罐內(nèi)正壓，打開自動(dòng)控溫系統(tǒng)的閥門和開關(guān)，溫度控制在37℃。3.3接種在火焰保護(hù)下，連接種子瓶和發(fā)酵罐接種口，打開發(fā)酵罐出氣閥關(guān)小發(fā)酵罐進(jìn)氣閥使罐內(nèi)壓力接近于0，確認(rèn)無誤后打開接種閥門，利用正壓空氣將二級(jí)種子按1%-2%的接種量接種于普通肉湯中，然后按2.5%加入40%滅菌葡萄糖溶液。3.4發(fā)酵培養(yǎng)接種后先小氣量通入無菌空氣2h，然后逐漸加大通氣量，每2h增加通氣量，培養(yǎng)后期每小時(shí)測(cè)定一次pH，當(dāng)pH上升到7.8時(shí)加入40%葡萄糖溶液2000ml調(diào)整pH，培養(yǎng)18～20小時(shí)，當(dāng)菌數(shù)將要達(dá)到最高峰時(shí)停止培養(yǎng)收獲菌液，將菌液放入滅菌大玻璃瓶中。4、配苗將事先準(zhǔn)備好的凍干保護(hù)劑加入收苗瓶中搖勻，保護(hù)劑和菌液的比例是1:7，明膠和蔗糖的最終含量分別是1.3%和5%。配苗完成后馬上進(jìn)行分裝和凍干。注意事項(xiàng)：1、培養(yǎng)基是菌苗生產(chǎn)的關(guān)鍵，一定要把握好原材料的質(zhì)量。2、發(fā)酵罐滅菌時(shí)，應(yīng)注意千萬不要留有死角，通氣管道壓力應(yīng)高于罐內(nèi)壓力，不要造成培養(yǎng)基倒吸入空氣過濾器。3、通氣培養(yǎng)