003-第二章-細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)

第二章細(xì)胞生長和產(chǎn)物生成的計(jì)量學(xué)與動(dòng)力學(xué)夏建業(yè)2023最新整理收集do

something2/48解決兩個(gè)基本問題:計(jì)量學(xué)問題——過程中涉及的各種物料和能量的比例關(guān)系；動(dòng)力學(xué)問題——細(xì)胞生長、底物消耗和產(chǎn)物生產(chǎn)的速率問題。3/48細(xì)胞反應(yīng)概論細(xì)胞的基本特征細(xì)胞組成：90%為C、H、O、N，還有S、P、Na、Ca、K、Cl、Mg、Fe八種元素，以上12種元素占細(xì)胞質(zhì)量的99%以上活細(xì)胞80~95%是水，干物質(zhì)中主要有蛋白質(zhì)、核酸、糖類和脂質(zhì)形狀：影響細(xì)胞生長速度，絲狀速度??；影響剪切耐受；影響傳質(zhì)大?。罕确磻?yīng)器足夠小，比分子足夠大物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸簡單擴(kuò)散；促進(jìn)擴(kuò)散；主動(dòng)輸運(yùn)胞內(nèi)代謝反應(yīng)供能反應(yīng)；生物合成反應(yīng)；多聚反應(yīng)；組裝反應(yīng)初級代謝與次級代謝胞內(nèi)代謝調(diào)控通過酶進(jìn)行調(diào)控：活性調(diào)節(jié)，酶量調(diào)節(jié)（誘導(dǎo)與阻遏）4/48第一節(jié)生物反應(yīng)過程的計(jì)量細(xì)胞的生長與代謝涉及大量的反應(yīng)成分和復(fù)雜的反應(yīng)途徑，但仍然服從物質(zhì)守恒定律。對于培養(yǎng)基組成，最簡單的計(jì)量學(xué)約束條件是：如果總細(xì)胞量要達(dá)到cx，元素i在細(xì)胞中的分率為Wi，那么，元素i在所有底物中的總量至少為Wicx。事實(shí)上，問題要復(fù)雜的多（1）某些底物中的元素變成產(chǎn)物，而非細(xì)胞物質(zhì)；（2）不僅要考慮計(jì)量學(xué)限制，還要考慮速率限制；（3）某些營養(yǎng)物是限制性的，或者某些產(chǎn)物是抑制性的。培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)種類很多，在計(jì)量學(xué)和動(dòng)力學(xué)上不可能一一考慮，必須找到問題的關(guān)鍵。5/48速率限制性底物：加入少量可使生長速率隨之增加的物質(zhì)。計(jì)量學(xué)限制性底物：首先消耗完的物質(zhì)（一個(gè)生長過程只有一種）。得率系數(shù)YX/S：增加的細(xì)胞量

被利用的底物量：YX/S=-

Cx/

Cs

總得率系數(shù)底物消耗：

CS=

CS同化

+

CS生長能

+

CS維持能

+

CS代謝產(chǎn)物其中真正的得率系數(shù)為－

CX/

CS同化恒定，而總總率系數(shù)往往不是常數(shù)。細(xì)胞迅速生長時(shí)，較多地底物用于同化和生長能，而靜止期的細(xì)胞消耗的底物則用于維持而不生長，此時(shí)YX/S=0。同化（assimilateoranabolism）：將外界環(huán)境中獲取的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞的組成成分，涉及一系列的生物合成，導(dǎo)向細(xì)胞合成異化（dissimilateorcatabolism）：細(xì)胞將大分分解為二氧化碳和水，異化過程為同化提供能量反應(yīng)計(jì)量學(xué)基本概念6/48二、研究方法：物料衡算（元素平衡）1.通用分子式碳源

CHxOy；氮源

HlOmNn；細(xì)胞

CH

O

N

2.無產(chǎn)物形成時(shí)的生長反應(yīng)3.元素平衡

C:a’+0+0=1+0+e’H:a’x+0+c’l=

+2d’+0O:a’y+2b’+c’m=+d’+2e’N:0+0+c’n=+0+0反應(yīng)過程的計(jì)量學(xué)方法7/484.呼吸商可由實(shí)驗(yàn)確定。由元素平衡和呼吸商可構(gòu)成矩陣方程：其中對該方程求解即可得到關(guān)于該生長反應(yīng)的計(jì)量學(xué)系數(shù)反應(yīng)過程的計(jì)量學(xué)方法8/48基本變量定義還原價(jià)分別表示生物體、碳源、氮源的還原價(jià)C的還原價(jià)為+4，H為+1，O為-2，N為-3。CHrOsNv

的還原價(jià)為εS

每個(gè)C原子底物水平磷酸化產(chǎn)生的ATP數(shù)P/O比細(xì)胞每消耗一個(gè)O原子的ADP磷酸化數(shù)，表征氧化磷酸化的效率，與培養(yǎng)條件有關(guān)9/48化學(xué)異養(yǎng)有氧生長計(jì)量學(xué)化學(xué)異養(yǎng)生物，有氧生長的計(jì)量學(xué)關(guān)系往往要復(fù)雜得多。若考慮ATP生成和利用，有如下關(guān)系：氧化磷酸化：能源異化：10/48化學(xué)異養(yǎng)有氧生長計(jì)量學(xué)維持和耗散：

生物合成：11/48當(dāng)有產(chǎn)物生成時(shí)1.通用分子式碳源

CHxOy；氮源

HlOmNn；細(xì)胞

CH

O

N

產(chǎn)物

CHvOw2.產(chǎn)物形成時(shí)的生長反應(yīng)3.元素平衡

C:a’+0+0=1+0+e’+f’H:a’x+0+c’l=

+2d’+0+f’vO:a’y+2b’+c’m=+d’+2e’+f’wN:0+0+c’n=+0+0+0反應(yīng)過程的計(jì)量學(xué)方法12/48部分宏觀得率系數(shù)匯總13/48例題葡萄糖為碳源，NH3為氮源進(jìn)行某種細(xì)菌的好氧培養(yǎng)，消耗的葡萄糖中有2/3的碳源轉(zhuǎn)化為細(xì)胞中的碳，反應(yīng)式為：計(jì)算上述反應(yīng)中的細(xì)胞得率YX/S和YX/O。14/48例題葡萄糖為唯一碳源進(jìn)行酵母培養(yǎng)，反應(yīng)式為試求：（1）細(xì)胞得率YX/S（2）生成1kg細(xì)胞的反應(yīng)熱？已知酵母細(xì)胞和葡萄糖的燃燒熱分別是1.5*104kJ/kg和1.59*104kJ/kg15/48例題某細(xì)胞反應(yīng)平衡式為：若上述反應(yīng)中：m=2，l=1,p=13/8,n=1/2,q=1/3試求該平衡式中計(jì)量系數(shù)a、b、c和RQ值，以及YX/S和YX/O的值16/48反應(yīng)計(jì)量學(xué)中的一些基礎(chǔ)知識(shí)獨(dú)立反應(yīng)數(shù)其中只有2個(gè)反應(yīng)是獨(dú)立的，因?yàn)槿我粋€(gè)反應(yīng)可由另兩個(gè)反應(yīng)線性組合而成。原子矩陣M為化合物，E為元素式中共S個(gè)物質(zhì)，R種元素17/48獨(dú)立反應(yīng)數(shù)也可以用化學(xué)計(jì)量系數(shù)法來確定，對于S種物質(zhì)A1,A2,…,As之間進(jìn)行R個(gè)反應(yīng)時(shí)，計(jì)量系數(shù)矩陣為可記作：ARs=(

ij)計(jì)量系數(shù)矩陣的秩為K，記作

r(A)=K此計(jì)量系數(shù)矩陣的秩即為獨(dú)立反應(yīng)數(shù)。反應(yīng)計(jì)量學(xué)中的一些技巧知識(shí)18/48細(xì)胞反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型的分類從細(xì)胞水平分非結(jié)構(gòu)化模型：不考慮胞內(nèi)存在的各種反應(yīng)和組分；細(xì)胞被視為組成恒定的生物相；唯一的變量是細(xì)胞濃度---（均衡生長）結(jié)構(gòu)化模型：胞內(nèi)存在若干關(guān)鍵組分或結(jié)構(gòu)單元；細(xì)胞組成和性質(zhì)將隨反應(yīng)進(jìn)行而變化；細(xì)胞需要多于一個(gè)以上的變量描述（非均衡生長）從細(xì)胞群體水平分非分離模型：不考慮細(xì)胞個(gè)體間的差異對反應(yīng)的影響分離模型：考慮細(xì)胞個(gè)體差異對反應(yīng)的影響19/48基本的動(dòng)力學(xué)機(jī)理非結(jié)構(gòu)模型1.假定細(xì)胞可以用單位體積中細(xì)胞的質(zhì)量或細(xì)胞個(gè)數(shù)表示，將細(xì)胞看作化學(xué)組成一定的反應(yīng)物，不考慮細(xì)胞生長過程中的內(nèi)部成分變化。2.整個(gè)培養(yǎng)過程中，細(xì)胞群體的質(zhì)量分布是均勻的。3.以底物、活細(xì)胞、非活細(xì)胞和分泌產(chǎn)物為主要成分。4.常采用速率限制性底物的概念。5.局限性：不適用于放大。底物S活菌X+活菌X非活菌Xd產(chǎn)物P菌體自溶20/48細(xì)胞反應(yīng)結(jié)構(gòu)模型結(jié)構(gòu)模型考慮細(xì)胞組成的多樣性及它們之間的反應(yīng)，將細(xì)胞分成幾個(gè)部分，如最簡單的結(jié)構(gòu)機(jī)理：細(xì)胞＝合成機(jī)構(gòu)（D）＋遺傳部分（G）。SDG21/48結(jié)構(gòu)化模型2.復(fù)雜的結(jié)構(gòu)化代謝模型22/48結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)模型的選擇如果僅是模擬反應(yīng)過程中生物質(zhì)的總量或濃度隨時(shí)間的變化，則可以采用最簡單的非結(jié)構(gòu)模型；如果是要模擬細(xì)胞內(nèi)部的生長動(dòng)態(tài)特性，則宜采用結(jié)構(gòu)模型處理。如果要研究不同細(xì)胞群體分布對細(xì)胞反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，則應(yīng)采用相應(yīng)的分離模型。23/48動(dòng)力學(xué)速率方程底物消耗細(xì)胞物質(zhì)需ATP需C源和N源產(chǎn)物底物氧化成CO2、水產(chǎn)ATP需C源和O2第一類產(chǎn)物（底物降解成簡單產(chǎn)物）乙醇、乳酸、檸檬酸、底物水平磷酸化、CO2、水產(chǎn)ATP需C源無O2第二類產(chǎn)物胞外酶、多糖、抗生素等需ATP需C源和N源第三類產(chǎn)物（含碳底物過量，含氮鎂等底物限制）蓄能化合物：胞內(nèi)糖原、脂肪、多糖需ATP需C源提供能量進(jìn)行合成反應(yīng)需ATP維持胞內(nèi)外濃度差異維持能需ATP胞內(nèi)轉(zhuǎn)化反應(yīng)需ATP24/48底物的流向25/48能源的產(chǎn)生與消耗NCHOO2CO2，H2O第一類產(chǎn)物第三類產(chǎn)物第二類產(chǎn)物細(xì)胞物質(zhì)用于維持的ATP26/48三個(gè)平衡方程C、N、O平衡總ATP平衡七個(gè)速率表達(dá)式氧消耗速率，rO菌體生成速率，rX第一類產(chǎn)物生成速率，rP1第二類產(chǎn)物生成速率，rP2第三類產(chǎn)物生成速率，rP3C底物總的消耗速率，rSN底物總的消耗速率，rN實(shí)際不能把氧化磷酸化產(chǎn)生的CO2和水和作為第一類產(chǎn)物的CO2區(qū)分開來，因此氧平衡往往被忽略四個(gè)獨(dú)立的速率方程27/48三個(gè)衡算式CNATP28/48S1限制性反應(yīng)步驟限制性途徑細(xì)胞生長與抑制限制性底物

假定速率控制反應(yīng)中，酶濃度正比于細(xì)胞濃度，底物濃度正比于限制性底物濃度，那么對于細(xì)胞生長，可以寫出與酶催化反應(yīng)米氏方程類似的形式：S2S329/48cS>>KS，μ為定值，則表明處于對數(shù)生長期，即rX與cX成正比。比生長速率與細(xì)胞倍增時(shí)間的關(guān)系：雙底物限制底物抑制生長抑制（底物、產(chǎn)物或其他物質(zhì)）Monod方程的特征—細(xì)胞生長速率30/48細(xì)胞維持速率方程產(chǎn)生維持能而消耗底物的速率：m=0.02~4kg底物/(kg細(xì)胞·h)根據(jù)消耗的ATP，維持方程為：mATP=0.5~200molATP/(m3·h)影響m值的因素：環(huán)境條件：培養(yǎng)基鹽濃度，pH（環(huán)境改變，細(xì)胞調(diào)節(jié)酶的表達(dá)，則蛋白的合成加快，使m值增加）細(xì)胞生長速率:生長條件不變時(shí),用于細(xì)胞物質(zhì)重新合成的維持能比較低,但當(dāng)停止生長,細(xì)胞適應(yīng)新的底物時(shí),就比較高。31/48細(xì)胞死亡速率方程非活性細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)化為非活細(xì)胞的速率：底物濃度對kd的影響：cS為0時(shí)，kd＝kdmax；cS很高時(shí)，kd最小。死亡——水解假死——短期不會(huì)轉(zhuǎn)化為活性細(xì)胞32/48產(chǎn)物形成速率方程產(chǎn)物形成的模型：1.乳酸發(fā)酵為厭氧過程，因此，沒有第二類和第三類產(chǎn)物生成，即rO=0，rP2=0，rP3=0。對第一類產(chǎn)物乳酸作ATP平衡：其中rmATP=mATPcX，則2.第二類產(chǎn)物：維持高有利于第一類產(chǎn)物的形成抑制細(xì)胞生長，氧攝取速率大有利于第二類產(chǎn)物的形成33/48葡萄糖生成乙醇為例34/48溫度的影響當(dāng)溫度低于最適生長溫度時(shí)：Ea為細(xì)胞生長活化能，50~70kJ/mol當(dāng)溫度高于最適溫度時(shí)，細(xì)胞的凈比生長速率μ可表示為kd也可表示為:Ed為死亡活化能，300~380kJ/mol溫度和pH的影響35/482.pH的影響（在酶特性基礎(chǔ)上建立起來，而酶由氨基酸組成，因而具有酸、堿和中性形式）

K1

K2

酸性X+?活細(xì)胞X?堿性X-

活細(xì)胞分率對于多數(shù)細(xì)胞，pHopt＝6.5±1，pK2-pK1＝2±136/48重組微生物的穩(wěn)定性

重組微生物表達(dá)外源蛋白的過程中，隨著代數(shù)的增加，產(chǎn)物的產(chǎn)率下降，這是由于重組微生物的穩(wěn)定性問題造成的，其機(jī)理為：（1）細(xì)胞分裂時(shí)，質(zhì)粒的缺陷性分配；（2）質(zhì)粒DNA突變導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性。37/48例題在分批操作反應(yīng)器中利用攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)行重組蛋白的生產(chǎn)。每經(jīng)過一世代，其質(zhì)粒丟失的概率為0.005，無質(zhì)粒細(xì)胞的比生長速率為1.4h-1，帶質(zhì)粒細(xì)胞的比生長速率為1.2h-1。如果接種時(shí)均為帶質(zhì)粒的細(xì)胞，試估計(jì)經(jīng)過18h培養(yǎng)后，攜帶質(zhì)粒細(xì)胞所占分率？該問題如何求解？38/48重組微生物的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)Xc：攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞；Xf：質(zhì)粒丟失的細(xì)胞；p：每次分裂產(chǎn)生質(zhì)粒丟失的細(xì)胞的概率；Np：N個(gè)細(xì)胞經(jīng)過一次分裂，產(chǎn)生質(zhì)粒丟失的細(xì)胞個(gè)數(shù)；N(1-p)：N個(gè)細(xì)胞經(jīng)過一次分裂，產(chǎn)生攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞個(gè)數(shù)；N(2-p)：N個(gè)細(xì)胞經(jīng)過一次分裂，攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞總數(shù)；

+：攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞在對數(shù)生長期的比生長速率；

-：質(zhì)粒丟失的細(xì)胞在對數(shù)生長期的比生長速率。Xc(2-p)XcpXf

+

+Xf2Xf

-39/48攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞生長速率丟失質(zhì)粒的細(xì)胞生長速率假定為常數(shù)，則代入第二個(gè)方程，得求解非齊次線性微分方程，得則攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞分率為40/48攜帶質(zhì)粒細(xì)胞的倍增時(shí)間：經(jīng)過時(shí)間t后攜帶質(zhì)粒細(xì)胞的培養(yǎng)代數(shù)：如果開始都是攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞，培養(yǎng)到n代時(shí)的f為：結(jié)合和可以得出：41/48f25隨

，p的增加而減少，p≤0.01和

<1時(shí)，f25接近1。p固定，f隨

，n的增加而減少，

＝1.4，n≈

30時(shí)，f≈0，

＝2.0，n≈14時(shí)，f≈0。42/48例題Q6:Estimatethenumberofgenerationsofgrowthneededforgeneticallymodifiedmicroorganismsfrom1mlculturetoa33,000Lproduction-scalefermenter.Assumethattheinoculumsizeineachstageofthescale-upis5%exceptthefirstinoculationstep.A:Inoculumsize=5%exceptthefirstinoculationstep.0.001

0.010

0.206

4.125

82.5

1650

33000放大倍數(shù)：33000/0.001=33000000分裂n次后的總量：N=N0

2

2

=N02n放大倍數(shù)=N/N0=N02n/N0=2n傳代數(shù)n=ln放大倍數(shù)/ln2總傳代數(shù)=5

ln20/ln2+ln10/ln2≈2543/48Q7:Forarecombinantmicroorganism(E.coli)containingplasmids,theprobabilitypergenerationofproducingacellwithoutplasmid(p)is0.001andtheratioofthespecificgrowthrates,

-/+is1.2.Calculatethefractionoftheplasmid-carryingcellswhenthecellsarefullygrownina64Lfermenter.Theinoculationwascarriedoutbyseveralstepsfrom1mLstockculture.Theinoculumsizeforeachstepis2.5%.A:1mL→40mL→1.6L→64LEachscale-up,ln40/ln2=5.3generationsTotalgenerations5.3

3=1644/48連續(xù)攪拌發(fā)酵罐中的培養(yǎng)在連續(xù)攪拌發(fā)酵罐中，對于攜帶質(zhì)粒細(xì)胞的物料平衡為:對于丟失質(zhì)粒細(xì)胞的