瑞香狼毒花粉浸提液對花粉萌發(fā)和種子結(jié)實的化感作用

瑞香狼毒花粉浸提液對花粉萌發(fā)和種子結(jié)實的化感作用

花粉轉(zhuǎn)化是一種以花粉為中心的現(xiàn)象。花粉對其他種類的花粉、花粉管的生長、花柱、胚胎、發(fā)芽和生長有負效應(yīng)。目前,雖然發(fā)現(xiàn)了一些具有花粉化感作用的物種,比如農(nóng)作物,像玉米(ZeamaysL.var.chalqui?ocónicoHernández);野草,像貓尾草(PhleumpretenseL.)、橘色山柳蘭(HieraciumaurantiacumL.)、黃色山柳蘭(H.pratense)和銀膠菊(PartheniumhysterophorusL.)。瑞香狼毒隸屬于瑞香科狼毒屬。它主要生長于海拔1000—4200m,干燥向陽山坡以及高山、亞高山草地、灌叢或松林下。在我國,它廣泛分布于西北、西南、東北、華北各省,以及臺灣省等地,主要分布于青海省的天然草地,四川省的甘孜州、阿壩州天然草場以及涼山州的西北部的高山、亞高山草甸區(qū)。目前國內(nèi)外對瑞香狼毒的研究很多,但集中在藥用價值以及種群分布格局和散布機制上,而對其生態(tài)學(xué)效應(yīng)的研究不多。狼毒是一種具有很強入侵性的毒草。據(jù)不完全統(tǒng)計,目前僅在中國西部就有133萬hm2。它已經(jīng)成為我國危害最嚴重的草地雜草之一。目前在青藏高原東部高寒草甸上狼毒危害比較嚴重,大面積可食的禾草和嵩草被狼毒取代。而且,在過度放牧的背景下,狼毒危害面積還在不斷蔓延。狼毒蔓延將產(chǎn)生怎樣的生態(tài)學(xué)效應(yīng),值得研究。狼毒的花較大,花朵鮮艷,能夠吸引大量傳粉昆蟲;在青藏高原東部的高山草甸,狼毒花期從每年的6—8月份,花期較長;當(dāng)?shù)匚锓N豐富,與狼毒同花期的物種很多;狼毒的頭狀花序的每個小花都能產(chǎn)生大量花粉,這些花粉對人眼、鼻、喉有較強烈而持久的辛辣性刺激。同時,據(jù)觀察,在青藏高原東部的高山草甸,存在豐富、大量的傳粉昆蟲,種間的花粉傳播行為頻繁發(fā)生。假設(shè)狼毒可能通過花粉化感作用抑制同花期的其它物種的花粉萌發(fā)和種子結(jié)實,進而對其它物種種群的有性繁殖產(chǎn)生負作用。1學(xué)習(xí)方法1.1亞高山草地土pall研究地點位于四川省松潘縣尕米寺附近(北緯32°53′,東經(jīng)103°40′,海拔3190m)。研究地年均溫2.8℃;最冷月1月份均溫-7.6℃,最熱月7月份均溫9.7℃。當(dāng)?shù)貨]有絕對無霜期。每年的日照時數(shù)平均為1827.5h。0℃以上積溫為428.6℃。年均降水量717.7mm,其中72%的降水分布在6—8月份。整個研究區(qū)域是典型的高寒草甸,嵩草屬(Kobresiaspp.)和早熟禾屬(Poaspp.)的物種占優(yōu)勢。其它的常見物種包括,草本:圓穗蓼(PolygonummacrophyllumD.Donvar.Macrophyllum,),秦艽(GentianamacrophyllaPall.var.fetissowii),濕生扁蕾(Gentianopsispaludosa(Hook.f.)Mavar.paludosa),鱗葉龍膽(GentianasquarrosaLedeb.),橢圓葉花錨(HaleniaellipticaD.Donvar.elliptica),藍鐘花(CyananthushookeriC.B.Cl.var.grandiflorusMarq.),小米草(EuphrasiapectinataTen.),川西翠雀花(DelphiniumtongolenseFranch.),高原毛茛(Ranunculustanguticus(Maxim.)Ovcz.var.tanguticus)和鵝絨委陵菜(PotentillaanserinaL.var.anserina),高山龍膽(GentianaalgidaPall.),小柴胡(BuplerumtenueBuch-Han.exD.Don),條葉銀蓮花(Anemonetrullifoliavar.linearis(Bruhl)Hand.-Mazz.),紅花芹(Tongoloadunnii(Boiss.)Wolff),矩鐮夾苜蓿(Medicagoarchiducis-nicolai)和甘青老鸛草(GeraniumpylzowianumMaxim);灌木:蒙古繡線菊(SpiraeamongolicaMaxim.var.mongolica),平枝栒子(CotoneasterhorizontalisDecne)。土壤屬于亞高山草甸土,其中含有19%粘粒,66%粉粒和15%沙粒。2007年6月初,在研究地進行群落調(diào)查。研究地單位面積上的物種密度見表1。同時,觀察狼毒與其它物種間的傳粉行為。1.2花粉浸提液及培養(yǎng)基的制備室內(nèi)花粉萌發(fā)試驗物種選擇:選擇6種研究地主要物種進行花粉萌發(fā)室內(nèi)研究,包括秦艽、濕生扁蕾、鱗葉龍膽、橢圓葉花錨、高原毛茛和鵝絨委陵菜。同時,用狼毒花粉浸提液對自身花粉進行萌發(fā)測試。花粉萌發(fā)培養(yǎng)基的制備:培養(yǎng)基是均一化的1%的乳酸瓊脂以及100μg/gH3BO4、300μg/gCaCL2和100μg/gKH2PO4的混合物。混勻后的培養(yǎng)基用0.1molL-1NaOH調(diào)節(jié)pH到5.8。培養(yǎng)基高壓滅菌消毒后密封保存在4℃下備用。此培養(yǎng)基在野外較高溫度時呈液態(tài),在20℃室溫下凝固成固態(tài)。它能夠提高潛在的花粉化感物質(zhì)的均質(zhì)性,同時不影響花粉的萌發(fā),并能通過為細胞膜內(nèi)磷脂提供碳水化合物減少花粉的失活。狼毒花粉浸提液的制備:從野外采集足夠數(shù)量的成熟的狼毒花,盡快用4℃的冰盒帶回實驗室。準(zhǔn)確稱取0.0001g狼毒花粉,稀釋,在200(20倍物鏡×10倍目鏡)顯微鏡下計數(shù)。稱量25000000個狼毒花粉,置于100mL容量瓶中,加蒸餾水定容到100mL,制成100mL250000個花粉/mL的貯存溶液。在4℃下浸提12h,使之通過20μm濾網(wǎng)以濾去花粉。分別取上述濾液0.4,4,8,12,20,40,80mL,與培養(yǎng)基溶液一起加于1L容量瓶中,制成0.1,1,2,3,5,10,20個花粉/μL的花粉浸提——培養(yǎng)基混合液備用。保存于4℃下。用培養(yǎng)基對照。對同花期其它物種花粉萌發(fā)的影響試驗:把上述不同濃度的花粉浸提——培養(yǎng)基混合液加到經(jīng)滅菌處理的培養(yǎng)皿中,溶液混勻攤平至小于1mm厚,封口膜密封,用4℃冰盒帶至野外。每個研究物種每個濃度設(shè)置8個重復(fù),即8個表面皿(考慮到菌類污染容易發(fā)生;若無污染,只觀察5個重復(fù))。在野外,取受試物種的花粉,加入到上述培養(yǎng)皿中,并盡可能使之分散均勻。立即帶回實驗室。在室溫20℃左右萌發(fā)8h;加入乙醇,阻止花粉管繼續(xù)伸長。萌發(fā)期間不斷觀察,去除被微生物污染的培養(yǎng)皿(由于細菌和真菌的生長速度快于花粉萌發(fā),可以區(qū)分兩者)。用200倍的顯微鏡觀察,估計萌發(fā)的花粉(花粉管完整,延長至超過花粉直徑即算萌發(fā))的百比例。1.3種子結(jié)實試驗野外種子結(jié)實率試驗物種選擇:選擇4個物種進行研究,包括秦艽、濕生扁蕾、鱗葉龍膽和橢圓葉花錨。對同花期其它物種種子結(jié)實率的影響試驗:應(yīng)用貯存液配制濃度分別為1,3,5,10,20個花粉/μL狼毒花粉浸提液,加到其它物種柱頭上進行試驗。同時,設(shè)置兩個對照組,一個是以蒸餾水作對照組(用0.1molL-1HCl調(diào)節(jié)pH至5.8),一個以完全不作處理作對照組。浸提液和蒸餾水用4℃的冰盒帶至野外。在7月中旬狼毒盛花期進行試驗。在花柱上施加浸提液或蒸餾水之前1—3d,用罩袋(可阻止花粉傳播)把花與外界隔離開。在上述樣地設(shè)置下隨機選取50個樣方;在每個樣方內(nèi),每個物種每個濃度隨機選1個植株,每個植株的花序上選1—10朵花的花柱;去掉該植株上其它的花或花序,保證每個植株上有相等數(shù)量的花或花序。取下罩袋后,用針頭在柱頭上施加半滴狼毒花粉浸提液。1h后,用小刷子在受試物種的柱頭上涂抹自種花粉,保證足夠多得自種花粉。重新安置罩袋;在花開過之后,移去罩袋。在500m外的無狼毒樣地上,用蒸餾水做類似試驗,并作無任何處理對照。種子成熟后收集、干燥和計數(shù)。用蒸餾水的試驗中,各物種的種子結(jié)實率是以蒸餾水處理中的種子結(jié)實數(shù)除以無任何對照處理中平均的種子結(jié)實數(shù);用狼毒花粉浸提液的試驗中,各物種的種子結(jié)實率是以一系列狼毒花粉浸提液處理中的種子結(jié)實數(shù)除以蒸餾水處理中平均的種子結(jié)實數(shù)。2結(jié)果2.1狼毒花粉浸提液濃度對花粉萌發(fā)的影響研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),狼毒花粉對自身花粉的萌發(fā)沒有顯著影響(圖1)。其它6個主要物種(包括秦艽、濕生扁蕾、鱗葉龍膽、橢圓葉花錨、高原毛茛和鵝絨委陵菜)的花粉萌發(fā)率均隨狼毒花粉浸提液濃度的增加而呈非線性降低,5個狼毒花粉浸提液對其它物種花粉萌發(fā)有顯著抑制作用(圖2a—j)。它們的50%花粉萌發(fā)抑制所需的狼毒花粉浸提液濃度數(shù)據(jù)見表2。50%花粉萌發(fā)抑制需要最低浸提液濃度的物種是橢圓葉花錨,需0.7個μL-1;最高的是高原毛茛,需3.7個μL-1。除了高原毛茛之外,多數(shù)物種在3個μL-1濃度時,就有50%的花粉不能萌發(fā)。2.2狼毒花粉浸提液對種子粘結(jié)的影響設(shè)置的2個對照組,即不作任何處理對照組和在柱頭上加入蒸餾水的對照組,的種子結(jié)實率稍有不同(設(shè)定不作任何處理對照組種子結(jié)實率為100%)(表3)。其它4個主要物種(包括秦艽、濕生扁蕾、鱗葉龍膽和橢圓葉花錨)的種子結(jié)實率均隨狼毒花粉浸提液濃度的增加而呈非線性降低(以不作任何處理為對照組)(圖3a—f)。1個狼毒花粉的浸提液通常不會影響其它物質(zhì)的種子結(jié)實;在有5個狼毒花粉時,受試4個物種種子結(jié)實率降低40%到65%。3討論3.1從四、有效同時進行圖書館和受試物的花粉化感后,各有側(cè)重、分狼毒花粉浸提液沒有對自身的花粉萌發(fā)產(chǎn)生負影響(圖1)。一般來說,種群不會產(chǎn)生干擾自身有性繁殖的特質(zhì)。這與土壤中的情況不太一樣。在土壤中,自毒是一種影響種間競爭的常見的化感作用方式。狼毒花粉對自毒效應(yīng)的缺乏可能表明,在狼毒花粉內(nèi)可能含有抗御花粉化感物質(zhì)的成分存在。50%花粉萌發(fā)抑制需要最低浸提液濃度的物種是橢圓葉花錨,只需0.7個μL-1;最高的是高原毛茛,需要3.7個μL-1(表2)。這可能暗示橢圓葉花錨的花粉萌發(fā)更容易受到狼毒花粉化感物質(zhì)的抑制,而高原毛茛正好相反。除了高原毛茛之外,多數(shù)物種在3個μL-1濃度時,就有50%的花粉不能萌發(fā)(表2),表明3個狼毒花粉的浸提液即有較強的花粉萌發(fā)抑制作用。受試的6個物種的花粉萌發(fā)率均隨狼毒花粉浸提液濃度的增加呈非線性降低(圖2a—f)。這種非線性曲線被認為是花粉化感的特征曲線。除了花粉化感之外,還有一些其它的因素也可以影響花粉的萌發(fā)率,比如培養(yǎng)基的毒性、不適當(dāng)?shù)慕櫤蜐B透壓、缺氧和極端的pH,它們可能導(dǎo)致花粉和花粉管的破裂。而花粉化感作用允許花粉浸潤并保持完整,但卻抑制花粉的萌發(fā)。同很多化感物質(zhì)一樣,花粉化感物質(zhì)導(dǎo)致非線性降低。而其它因素,比如pH和其它一些因素都將導(dǎo)致花粉萌發(fā)率的線性降低。花粉質(zhì)量可能隨環(huán)境條件的變化而改變,尤其是對那些花期較長的物種,花粉質(zhì)量在整個花期可能會發(fā)生較大變化。如果考慮到狼毒花期較長,那么在整個花期,狼毒花粉質(zhì)量可能發(fā)生較大變化,進而對其它物種花粉萌發(fā)的影響可能不同。因此有必要進一步研究狼毒花粉在不同年份和不同開花時間的影響。同時,不同種群的狼毒間花粉質(zhì)量也可能存在顯著差異,因此有必要進行跨地區(qū)的研究。在本研究中,狼毒花粉是從種群水平上,即不同狼毒植株上,采集、試驗的;受試物種的花粉也是在種群水平上取得的。因此,狼毒種群內(nèi)個體間花粉化感的差異,或者受試物種個體間對花粉化感的相應(yīng)差異還有待研究。此外,在實驗室中用狼毒花粉浸提液作的研究與實際的野外條件有兩方面差別:一是在柱頭上,狼毒花粉產(chǎn)生的是一個異質(zhì)性的環(huán)境;二是即使狼毒花粉散落在柱頭上,仍然可能沒有溶液將其中的化感物質(zhì)傳遞到柱頭上。3.2花粉浸提液對種子結(jié)實的影響研究發(fā)現(xiàn),與不作任何處理對照組相比,加入蒸餾水對照組種子結(jié)實率略有下降,可見加入蒸餾水對種子結(jié)實有一定影響,但是影響不大(表3)。在有5個狼毒花粉時,受試4個物種種子結(jié)實率降低40%到65%(圖3a—d)。狼毒的花粉浸提液與真正的花粉的效果肯定不會完全一致,但是,已有的研究表明,真正花粉的化感效果強于花粉浸提液,所以5個狼毒花粉的浸提液可能大大降低種子的結(jié)實率。1個狼毒花粉的浸提液通常不會影響其它物質(zhì)的種子結(jié)實(圖3a—d)。這與實驗室中的結(jié)果有所不同(圖2a—f),實驗室中,相同的花粉浸提液的效果更明顯。已有研究發(fā)現(xiàn),實驗室中花粉浸提液的毒性和對有性繁殖的影響更大。本文研究結(jié)果與之相似。與實驗室中花粉萌發(fā)率降低的非線性曲線相似,種子結(jié)實率降低的曲線也是非線性的(圖3a—f)。在以異種花粉散布為媒介的各種作用中,梗塞可能是最容易與花粉化感作用相區(qū)別的。是否梗塞是一種常見現(xiàn)象有待證明,至少在本研究中,種子結(jié)實率的降低不是由于狼毒花粉的梗塞作用造成的,因為在實驗中應(yīng)用的是狼毒花粉的浸提液。而且,即使應(yīng)用真正的狼毒花粉到其它物種的柱頭上,梗塞現(xiàn)象導(dǎo)致的種子結(jié)實率的降低也不應(yīng)該是非線性的。因為梗塞應(yīng)該是一對一的影響,即一?；ǚ蹖?dǎo)致一個種子不能結(jié)實;梗塞不會導(dǎo)致花粉萌發(fā)率和種子結(jié)實率的非線性降低。而花粉化感則不同:一粒狼毒花粉可以抑制超過一粒受試物種花粉的萌發(fā),它的影響范圍也超過一粒受試物種花粉的大小。因此,種子結(jié)實率的非線性降低說明有花粉作用存在。這種非線性可能是花粉化感作用的特征曲線。通過實驗室的花粉萌發(fā)試驗證明