DB4415-T 24-2023甘薯病毒分子檢測技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20CCSB05

4415汕 尾 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB4415/T24—2023甘薯病毒分子檢測技術(shù)規(guī)程Technicalregulationsformoleculardetectionofsweetpotatovirus2023-09-142023-09-142023-10-08汕尾市市場監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定編寫。本文件由汕尾市市場監(jiān)督管理局提出并歸口。本文件起草單位:汕尾市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。甘薯病毒分子檢測技術(shù)規(guī)程范圍本文件適用于汕尾市區(qū)域內(nèi)甘薯脫毒組培苗、原原種、原種以及生產(chǎn)用種的病毒分子檢測。（GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T402脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測技術(shù)規(guī)程SN/T2122進(jìn)出境植物及植物產(chǎn)品檢疫抽樣方法SN/T2964植物病毒檢測規(guī)范下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1分子檢測moleculardetection下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1分子檢測moleculardetection以功能基因、核糖體、ITS等區(qū)域?yàn)闃?biāo)靶，采用分子生物學(xué)的方法在基因水平上對物種進(jìn)行鑒定。3.2引物primer3.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR;polymerasechainreaction在DNADNADNADNADNA3.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR;reversetranscriptionpolymerasechainreactionRNADNADNAPCRRNADNAa）甘薯類花椰菜花葉病毒（SPCV）b)甘薯曲葉?。⊿PLCV）RNAG（SPVG）（SPLV）（CMV）SN/T2122SN/T2964合適的取樣計劃，進(jìn)行再次取樣。6檢測合適的取樣計劃，進(jìn)行再次取樣。6檢測（PCR）檢測用于檢測甘薯DNA病毒。試劑及緩沖液用水應(yīng)符合GB/T6682的規(guī)定，配置按NY/T402附錄C.1執(zhí)行。DNA樣品DNA的提取按NY/T402附錄C.2執(zhí)行。以ddH2O作為檢測的陰性對照。引物a）甘薯類花椰菜花葉病毒（SPCV）:F-AGGAAATCCCAGTATTATTCAAC，R-ATTTCTAATTTGGTTTACTAATCC，擴(kuò)增產(chǎn)物922bp；b）甘薯曲葉?。⊿PLCV）：F-CCYTAGGGTTCGAGCTVTGTTCGG，R-TTTATTAATTDTTRTGCGAATC，擴(kuò)增產(chǎn)物823bp。6.1.5PCR擴(kuò)增DNAPCR（25μL）DNA（100ng/μL）2μL，2×TaqMasterMix12.5μL，（10μmol/L）1μL，ddH2O25μL94℃2min；94℃3045s，68℃1min，3068℃10min；4℃6.1.6PCR產(chǎn)物的電泳檢測10μLPCR1μL10×loadingBuffer1%（120V～150V）20min～30min，EB用于檢測甘薯RNA病毒。試劑及緩沖液用水應(yīng)符合GB/T6682的規(guī)定，配置按NY/T402附錄D.1執(zhí)行。RNA樣品RNA的提取按NY/T402附錄D.2執(zhí)行。以ddH2O作為檢測的陰性對照。引物（SPCSV）：F-CGGTCARATTGGAAGGT，R-TTCGCTATCAAAGAAGTRTC，擴(kuò)增產(chǎn)物304bp；（SPFMV）：F-GCATGGTATGARGGAGTYAA，R-TCTTCTTCTTGCGTGGAG，擴(kuò)增產(chǎn)物589bp；G（SPVG）：F-GTATGAAGACTCTCTGACAAATTTTG，R-TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA，擴(kuò)增產(chǎn)物1191bp；（SPLV）：F-GCCGAYGAAACCATCMTCGAT，R-GTCTCYGGTATAAGACAAAAAG，擴(kuò)增產(chǎn)物1076bp；（SPCFV）：F-CTATGCTGCTCACTCAAGC，R-TTGATTGGCCACAAGCGAAG，擴(kuò)增產(chǎn)物600bp；（SPVMV）：F-GCGAATTCTCAAGCACTGAAGAAAC，R-CTCTCGAGTTACTGCACACCTCTCATT，擴(kuò)增產(chǎn)物1015bp；（CMV）:F-ATGGACAAATCTRAATCAACCAG，R-TCARACTGGGAGCACYCCWGAYGT，擴(kuò)增產(chǎn)物657bp；反轉(zhuǎn)錄過程按NY/T402附錄D.3.2執(zhí)行。PCRRNAPCR（25μL）cDNA2μL，2×TaqMasterMix12.5μL（10μmol/L）1μL，ddH2O25μL：94℃2min；