-焦磷酸測(cè)序法快速鑒定副溶血性弧菌

PCR-焦磷酸測(cè)序法快速鑒定副溶血性弧菌 通過(guò)短片段基因序列測(cè)定檢測(cè)副溶血性弧菌。方法通過(guò)對(duì)副溶血性弧菌pR72H基因保守片段的焦磷酸測(cè)序，達(dá)到鑒定副溶血性弧菌的目的。結(jié)果通過(guò)焦磷酸測(cè)序?qū)R72H基因上的18bp的保守片段進(jìn)行測(cè)定可準(zhǔn)確檢測(cè)56株副溶血性弧菌。結(jié)論建立的方法具有準(zhǔn)確、快速和實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，適于對(duì)pH72R的快速、高通量檢測(cè)。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus，VP)是一種革蘭陰性嗜鹽桿菌，是引起食源性疾病的重要病原之一。該菌主要分布于沿岸海水、海河交界處及海產(chǎn)品中，是沿海地區(qū)引起食物中毒的重要病原菌。它在海產(chǎn)品上的帶菌率高達(dá)45.7%[1]，其生長(zhǎng)速度是一般細(xì)菌(如大腸埃希菌、沙門(mén)菌等)的2倍，因而更易于引起食物中毒?；颊咭匝睾５貐^(qū)居多,是食品檢驗(yàn)的必檢項(xiàng)目。焦磷酸測(cè)序技術(shù)是近幾年發(fā)明的一種實(shí)時(shí)DNA序列分析技術(shù)，以快速、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)分析DNA序列見(jiàn)長(zhǎng)。該技術(shù)的發(fā)明，使得快速、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)地進(jìn)行短DNA序列分析成為可能。自該技術(shù)發(fā)明以來(lái)，已廣泛應(yīng)用于SNP分析，細(xì)菌、真菌和病毒的分型、突變位點(diǎn)的檢測(cè)等[2～5]。在微生物的檢測(cè)中也得到廣泛的應(yīng)用，但常見(jiàn)報(bào)道為應(yīng)用16SrRNA基因?yàn)槟康幕?，選取其中的變異區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和測(cè)序，但由于16SrRNA檢測(cè)容易污染，常導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確。本研究針對(duì)VP菌的保守基因pR72H的一段保守片段設(shè)計(jì)引物，通過(guò)焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)其保守片段，建立了VP的焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法，現(xiàn)匯報(bào)如下。1材料與方法1.1菌株研究用56株VP分離菌株均來(lái)自2005-2009年的食源性疾病檢測(cè)，均經(jīng)API20E微生物生化鑒定系統(tǒng)鑒定，由本中心菌毒種保藏室提供。標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802由河北省疾病預(yù)防控制中心贈(zèng)與。陰性對(duì)照菌株沙門(mén)菌（H9812）、阪崎腸桿菌（45301）、普通變形桿菌（49100）、奇異變形桿菌（49106）、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（52302）、單增李斯特菌（54003）、大腸埃希菌（8099）、弗勞地檸檬酸桿菌（48014）、銅綠假單胞菌（ATCC15442）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、痢疾志賀菌（51080）、福氏志賀菌（51079）、鮑氏志賀菌（51189）等標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；宋內(nèi)志賀菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、假結(jié)核耶爾森菌、無(wú)害李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、雷氏普羅威登斯菌等為本中心的分離株；海蛹弧菌（1.1623）、需鈉弧菌（1.1619）、韋式弧菌（1.1612）、河流弧菌（1.1608）、創(chuàng)傷弧菌（1.1758）、解蛋白弧菌（1.1833）等標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。1.2儀器和試劑GoTaqMasterMix（Promega公司），PyroGoldReagents（瑞典Biotage公司），PCRSystem9700型（美國(guó)PE公司），PyroMarkID檢測(cè)系統(tǒng)（瑞典Biotage公司）。1.3引物設(shè)計(jì)載NCBI基因文庫(kù)公布的各種細(xì)菌的pR72H基因序列60條，以DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)，查找VP菌的保守片段，利用PyroMarkID檢測(cè)系統(tǒng)的AssayDesign軟件以L30116.1序列為模板，針對(duì)保守序列設(shè)計(jì)焦磷酸測(cè)序的PCR擴(kuò)增引物和測(cè)序引物。上游引物（391-413bp）：5’-AAAGGATACGCTTTAAAACACCG-3’（23bp）,生物素標(biāo)記5’端；下游引物（535-516bp）：5’-GAAGTAGCCCGAATCCTTGA-3’（20bp）；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度145bp；測(cè)序引物（518–501bp）：5’-TGAACATACGCAGCTAAT-3’(18bp)。1.4DNA模板的制備將各菌株復(fù)蘇后劃線接種各自選擇性平板，過(guò)夜培養(yǎng)，用10μL吸頭挑取1~3個(gè)細(xì)菌克隆懸于50μl1×TE溶液（pH8.0）中，在管壁適當(dāng)研磨，震蕩混勻，短暫離心，沸水浴5min，冷卻至室溫，12000rpm離心5min，取上清，分裝保存于-20℃作為DNA模板。1.5PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系50μl:2×GoTaqMasterMix25μl，上游引物和下游引物各10pmol，DNA模板2μl，加無(wú)菌去離子水至50μl。擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，94℃變性20s，56℃退火30s，72℃延伸20s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。取反應(yīng)產(chǎn)物5μl上樣，QIAxcel全自動(dòng)DNA/RNA分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。1.6單鏈模板制備將PCR產(chǎn)物25μl轉(zhuǎn)移至加有Sepharosebeads3μl和BindingBuffer47μl的96孔PCR板中,常溫混勻10min。打開(kāi)真空泵，依次將VacuumPrepTool在超純水中清洗30s、在96孔PCR板中抓取Sepharosebeads，隨后分別在70%乙醇、DenaturationBuffer、WashingBuffer中清洗5~10s，再將其放入預(yù)先加入0.3μmol/L測(cè)序引物和AnnealingBuffer（共45μl）的PSQ96孔板中充分震蕩搖動(dòng)釋放Sepharosebeads。1.7焦磷酸測(cè)序分析將放有樣品的PSQ96孔板80℃孵育2min，冷卻至室溫后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)。將酶混合物、底物混合物和四類核苷酸(A、T、C和G)分別加入試劑艙固定位置。設(shè)定程序，將試劑艙和PSQ96孔板放入機(jī)箱中進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。2結(jié)果2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果利用設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增各菌株的特異基因片段，僅見(jiàn)VP擴(kuò)增出長(zhǎng)度為145bp的目的片段，其他非VP菌的對(duì)照菌均無(wú)擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，不再進(jìn)行焦磷酸測(cè)序檢測(cè)。注：A01：分子量標(biāo)準(zhǔn)；A02~A12：部分VP菌PCR擴(kuò)增結(jié)果圖1部分VP菌PCR擴(kuò)增結(jié)果2.2焦磷酸測(cè)序結(jié)果按照10（TCGA）堿基順序加入程序進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，可很好測(cè)得每個(gè)菌株的目的片段序列CTGCACTTACAAACAGTT，經(jīng)NCBI的在線BLAST分析確證為VP的pR72H基因片段，測(cè)序結(jié)果完全正確。后經(jīng)在線BLAST分析發(fā)現(xiàn)CTGCACTTACAAACAGTT18個(gè)堿基的一段序列即可達(dá)到對(duì)VP的鑒定目的。本實(shí)驗(yàn)隨后又采用固定堿基加入序列（CTGCACTACACAGT）的方法進(jìn)行了焦磷酸測(cè)序檢測(cè)，結(jié)果與3討論由于副溶血弧菌引起的食源性疾病嚴(yán)重影響了食品公共安全，對(duì)其快速鑒定有著重要的意義。在眾多的方法中，DNA序列測(cè)定被認(rèn)為是鑒定病原菌的黃金標(biāo)準(zhǔn)。盡管有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，經(jīng)典的SangerDNA測(cè)序方法可以實(shí)現(xiàn)高度自動(dòng)化，但是當(dāng)所需DNA片段較短時(shí)，該方法比焦磷酸測(cè)序技術(shù)不僅耗時(shí)長(zhǎng)，而且費(fèi)用高，操作復(fù)雜。焦磷酸測(cè)序技術(shù)是短核苷酸序列實(shí)時(shí)測(cè)定的一種新方法，該方法既可以用于已知突變序列的驗(yàn)證性測(cè)序，也可以用于未知序列探索性測(cè)序[8～10]。該方法不僅具有Sanger測(cè)序法的高精確性，還具有高通量、高自動(dòng)化、高效、簡(jiǎn)單易行、省時(shí)省力等其它檢測(cè)技術(shù)不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將焦磷酸測(cè)序技術(shù)用于VP的快速檢測(cè)，通過(guò)針對(duì)保守基因pR72H的一段保守片段進(jìn)行測(cè)序，建立了一種新的用于鑒定VP的分子診斷方法。該方法特異性高，僅VP菌能得到很好的測(cè)序結(jié)果，其他非VP菌在PCR擴(kuò)增階段由于沒(méi)有得到目的條帶而得到排除。通過(guò)焦磷酸測(cè)序?qū)CR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分子水平的驗(yàn)證,避免了單純PCR擴(kuò)增檢測(cè)易污染造成的假陽(yáng)性結(jié)果，準(zhǔn)確性高。本研究采用優(yōu)化的焦磷酸測(cè)序反應(yīng)體系進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI的在線BLAST分析(/Blast.cgi)，顯示CTGCACTTACAAACAGTT18個(gè)堿基就可達(dá)到鑒定VP的目的；同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果峰圖分析發(fā)現(xiàn)，其信號(hào)清晰，分辨率高，信號(hào)強(qiáng)度與核苷酸一致不需標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，可由相關(guān)軟件進(jìn)行分析判斷，在一定的程度上避免了主觀因素帶來(lái)的誤差