據(jù)預(yù)處理方法

基因芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)基因芯片（gene

chip），又稱DNA微陣列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，其工作的基本原理是通過堿基互補(bǔ)配對(duì)檢測生物信息。實(shí)驗(yàn)要求：單通道——一張芯片檢驗(yàn)一種狀態(tài)

；雙通道——差異表達(dá)基因的篩選儲(chǔ)存的生物信息：寡核苷酸芯片（常為單通道）、cDNA芯片（常為雙通道）基因芯片制備樣品制備mRNA提取等雜交反應(yīng)信號(hào)檢測與分析基因芯片的實(shí)驗(yàn)流程（雙通道）單通道/雙通道基因芯片實(shí)例雜交完成后，要對(duì)基因芯片進(jìn)行“讀片”，即應(yīng)用激光共聚焦熒光掃描顯微鏡，對(duì)基因芯片表面的每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測?；蛐酒瑪?shù)據(jù)分析：對(duì)從基因芯片高密度雜交點(diǎn)陣圖中提取的雜交點(diǎn)熒光信號(hào)進(jìn)行定量分析，通過有效數(shù)據(jù)篩選和相關(guān)基因表達(dá)譜聚類，發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)譜和功能之間的聯(lián)系?；虮磉_(dá)值探針

？熒光值計(jì)算機(jī)“讀片”機(jī)理cDNA芯片、載有較長片段的寡核苷酸芯片采用雙色熒光系統(tǒng)：目前常用Cy3一dUTP（綠色）標(biāo)記對(duì)照組mRNA，Cy5一dUTP（紅色）標(biāo)記樣品組

mRNA用不同波長的熒光掃描芯片，將掃描所得每一點(diǎn)熒光信號(hào)值自動(dòng)輸入計(jì)算機(jī)并進(jìn)行信息處理，給出每個(gè)點(diǎn)在不同波長下的熒光強(qiáng)度值及其比值，同時(shí)計(jì)算機(jī)還給出直觀的顯色圖。在樣品中呈高表達(dá)的基因其雜交點(diǎn)呈紅色，相反，在對(duì)照組中高表達(dá)的基因其雜交點(diǎn)呈綠色，在兩組中表達(dá)水平相當(dāng)?shù)娘@黃色，這些信號(hào)就代表了樣品中基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。將樣品中的DNA/RNA標(biāo)上熒光標(biāo)記，則可以定量檢驗(yàn)基因的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)預(yù)處理分析流程：算法（以cDNA芯片為例）探針?biāo)綌?shù)據(jù)獲得（計(jì)算機(jī)掃描圖像）數(shù)據(jù)預(yù)處理：背景處理、數(shù)據(jù)清洗、提取表達(dá)值、標(biāo)準(zhǔn)化、匯總獲取基因表達(dá)數(shù)據(jù)：判斷差異基因表達(dá)聚類和分析1

探針?biāo)綌?shù)據(jù)（probe-level

data）的獲得提取生物樣品的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時(shí)用熒光素或同位素標(biāo)記。在液相中與基因芯片上的探針雜交，經(jīng)洗膜后用圖像掃描儀捕獲芯片上的熒光或同位素信號(hào)，由此獲得的圖像就是基因芯片的原始數(shù)據(jù)（raw

data），也叫探針?biāo)綌?shù)據(jù)。獲取探針?biāo)降臄?shù)據(jù)是芯片數(shù)據(jù)處理的第一步，然后需要對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理（pre-processing），以獲得基因表達(dá)數(shù)據(jù)（gene

expression

data）。基因表達(dá)數(shù)據(jù)是芯片數(shù)據(jù)處理的基礎(chǔ)?；蛐酒结?biāo)綌?shù)據(jù)處理的R軟件包有affy,

affyPLM,

affycomp,

gcrma等。2

預(yù)處理2.1

背景（background）處理背景處理即過濾芯片雜交信號(hào)中屬于非特異性的背景噪音部分。一般以圖像處理軟件對(duì)芯片劃格后，每個(gè)雜交點(diǎn)周圍區(qū)域各像素吸光度的平均值作為背景，但此法存在芯片不同區(qū)域背景扣減不均勻的缺點(diǎn)。也可利用芯片最低信號(hào)強(qiáng)度的點(diǎn)（代表非特異性的樣本與探針結(jié)合值）或綜合整個(gè)芯片非雜交點(diǎn)背景所得的平均吸光值做為背景。背景處理之后，我們可以將芯片數(shù)據(jù)放入一個(gè)矩陣中：其中，各字母的意義如下：N：條件數(shù)；G：基因數(shù)目（一般情況下，G>>N）；行向量mi=(mi1,mi2,…,miN)表示基因i在N個(gè)條件下的表達(dá)水平（這里指絕對(duì)表達(dá)水平，亦即熒光強(qiáng)度值）；列向量mj=(m1j,m2j,…,mGj)表示在第j個(gè)條件下各基因的表達(dá)水平（即一張芯片的數(shù)據(jù)）；元素mij表示第基因i在第j個(gè)條件下（絕對(duì)）基因表達(dá)數(shù)據(jù)。m可以是R（紅色，Cy5，代表樣品組）。也可以是G（綠色，Cy3,代表對(duì)照組）。；變異系數(shù)法（變異系數(shù)=均數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)差，如果變異系數(shù)接近或大于10%則認(rèn)為數(shù)據(jù)不可靠而刪除）；前景值＜200；前景值-平均數(shù)/前景值-中位數(shù)＜80%2.2

數(shù)據(jù)清洗（data

cleaning）經(jīng)過背景校正后的芯片數(shù)據(jù)中可能會(huì)產(chǎn)生負(fù)值，還有一些單個(gè)異常大（或?。┑姆澹ü龋┬盘?hào)（隨機(jī)噪聲）。對(duì)于負(fù)值和噪聲信號(hào)，通常的處理方法就是將其去除，常見數(shù)據(jù)經(jīng)驗(yàn)型舍棄方法有：標(biāo)準(zhǔn)值或奇異值舍棄法；變異系數(shù)法；前景值＜200；前景值-平均數(shù)/前景值-中位數(shù)＜80%等等。然而，數(shù)據(jù)的缺失對(duì)后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析（尤其是層式聚類和主成分分析）有致命的影響。Affy公司的芯片分析系統(tǒng)會(huì)直接將負(fù)值修正為一個(gè)固定值。對(duì)數(shù)據(jù)的刪除，通常是刪去所在的列向量或行向量。一個(gè)比較常用的做法是，事先定義個(gè)閾值M。若行（列）向量中的缺失數(shù)據(jù)量達(dá)到閾值M，則刪去該向量。若未達(dá)到M，有兩種方法處理，一是以0或者用基因表達(dá)譜中的平均值或中值代替，另一個(gè)是分析基因表達(dá)譜的模式，從中得到相鄰數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的關(guān)系，據(jù)此利用相鄰數(shù)據(jù)點(diǎn)估算得到缺失值（類似于插值）。填補(bǔ)缺失值（

k臨近法）：利用與待補(bǔ)缺基因距離最近的k個(gè)臨近基因的表達(dá)值來預(yù)測待填補(bǔ)基因的表達(dá)值。根據(jù)鄰居基因在樣本中的加權(quán)平均估計(jì)缺失值。數(shù)數(shù)據(jù)據(jù)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換換并并不不是是必必不不可可少少的的步步驟驟，，如如果果樣樣本本量量大大，，且且數(shù)數(shù)據(jù)據(jù)呈呈正正態(tài)態(tài)分分布布就就沒沒有有必必要要進(jìn)進(jìn)行行數(shù)數(shù)據(jù)據(jù)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換換。。因因?yàn)闉閿?shù)數(shù)據(jù)據(jù)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換換也也存存在在不不利利影影響響。。2.3

提取表達(dá)值由于芯片數(shù)據(jù)的小樣本和大變量的特點(diǎn)，導(dǎo)致數(shù)據(jù)分布呈偏態(tài)、標(biāo)準(zhǔn)差大。對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換能使上調(diào)、下調(diào)的基因連續(xù)分布在0的周圍，更加符合正態(tài)分布，同時(shí)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換使熒光信號(hào)強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)差減少，利于進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。cDNA芯片：對(duì)雙通道數(shù)據(jù)使用Cy5（紅）和Cys3（綠）兩種熒光標(biāo)記分別標(biāo)記case和control樣本的cDNA序列。掃描儀采用兩種波長對(duì)基因芯片的圖像進(jìn)行掃描，根據(jù)每個(gè)點(diǎn)的光密度值計(jì)算相對(duì)應(yīng)的絕對(duì)表達(dá)量(intensity)；然后圖像分析軟件通過芯片的背景噪音以及雜交點(diǎn)的光密度分析，對(duì)每個(gè)點(diǎn)的intensity校準(zhǔn)，利用Cy5/Cy3的值獲取case與control組不同基因的表達(dá)值ratio（（R/Gratio）；一般選擇以2為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)，比如R/G=1，則

log2R/G=0，即認(rèn)為表達(dá)量沒有發(fā)生變化，當(dāng)R/G=2

或者，R/G=0.5，則log值為1

或–1，這是可以認(rèn)為表達(dá)量都發(fā)生兩倍的變化。以下的數(shù)據(jù)處理都是對(duì)log2R/G的形式進(jìn)行分析。2.4

歸一化經(jīng)過背景處理和數(shù)據(jù)清洗處理后的修正值反映了基因表達(dá)的水平。然而在芯片試驗(yàn)中，各個(gè)芯片的絕對(duì)光密度值是不一樣的，在比較各個(gè)試驗(yàn)結(jié)果之前必需將其歸一化（normalization，也稱作標(biāo)準(zhǔn)化）。數(shù)據(jù)的歸一化目的是調(diào)整由于基因芯片技術(shù)引起的誤差，不是調(diào)整生物RNA

樣本的差異。在同一塊芯片上雜交的、由不同熒光分子標(biāo)記的兩個(gè)樣品間的數(shù)據(jù)，也需歸一化。常用的標(biāo)準(zhǔn)化方法有“看家基因法”、基于總光密度的方法、回歸方法、比率統(tǒng)計(jì)法等。比率統(tǒng)計(jì)法此方法用于標(biāo)準(zhǔn)化同一塊芯片上雜交的兩種樣品，并且建立于以下的假設(shè)之上：在近似的兩個(gè)樣品中，雖然基因有上調(diào)和下調(diào)，但一些基本的基因（如管家基因）的表達(dá)量是近似相同的。由此得出一個(gè)近似概率密度公式：比率T

=R

/G（R

和G分別是芯片上第K個(gè)點(diǎn)的紅光和綠光的強(qiáng)度），經(jīng)過迭代算法處理得到一個(gè)平均表達(dá)比率及其可信限，用于數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算。常用的方法是平均數(shù)、中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化(mean

or

median

normalization)：將各組實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的log

ratio

中位數(shù)或平均數(shù)調(diào)整在同一水平。中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化：將每個(gè)芯片上的數(shù)值減去各自芯片上log

Ratio值的中位數(shù)，使得所有芯片的log

Ratio值中位數(shù)就變成了0，從而不同芯片間logRaito具有可比性。3

差異基因表達(dá)分析經(jīng)過預(yù)處理，探針?biāo)綌?shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)榛虮磉_(dá)數(shù)據(jù)。為了便于應(yīng)用一些統(tǒng)計(jì)和數(shù)學(xué)術(shù)語，基因表達(dá)數(shù)據(jù)仍采用矩陣形式。倍數(shù)分析方法：倍數(shù)變換fold

change，單純的case與control組表達(dá)值相比較，對(duì)沒有重復(fù)實(shí)驗(yàn)樣本的芯片數(shù)據(jù)，或者雙通道數(shù)據(jù)采用這種方法（該方法是對(duì)基因芯片的ratio值從大到小排序，即cy5/cy3比值，一般0.5-2.0之間內(nèi)的基因不存在差異表達(dá)，范圍之外存在差異表達(dá)。缺點(diǎn)是倍數(shù)選取具有任意性，可能不恰當(dāng)）參數(shù)法分析（t檢驗(yàn)）：當(dāng)t超過根據(jù)可信度選擇的標(biāo)準(zhǔn)時(shí),

比較的兩樣本被認(rèn)為存在著差異。但小樣本基因芯片實(shí)驗(yàn)會(huì)導(dǎo)致不可信的變異估計(jì)，此時(shí)采用調(diào)節(jié)性T檢驗(yàn)。非參數(shù)分析：由于微陣列數(shù)據(jù)存在“噪聲”干擾而且不滿足正態(tài)分布假設(shè)，用t檢驗(yàn)有風(fēng)險(xiǎn)。非參數(shù)檢驗(yàn)并不要求數(shù)據(jù)滿足特殊分布的假設(shè)，所以可使用非參數(shù)方法對(duì)變量進(jìn)行篩選。如經(jīng)驗(yàn)貝葉斯法、芯片顯著性分析SAM法。常用的利用R的limma包使用t檢驗(yàn)篩選差異表達(dá)基因，利用R的siggenes包使用SAM方法篩選差異表達(dá)基因。False

Discovery

Rate

(FDR)在基因芯片的實(shí)驗(yàn)中，每一個(gè)基因/探針，都是一個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)?；蛐酒焊咄?，>1,000個(gè)基因/探針。

因此，無論怎么比較，總會(huì)有一些基因會(huì)是統(tǒng)計(jì)顯著性差異表的——

可能是隨機(jī)產(chǎn)生的。如何評(píng)估表達(dá)差異基因預(yù)測的有效性？

FDR

=

p-value

*

No.

of

Genes例：1,000個(gè)探針的雙通道芯片，以p-value

<

0.01為域值，發(fā)現(xiàn)7個(gè)上調(diào)基因，5個(gè)下調(diào)基因，分析結(jié)果是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義？計(jì)算：

FDR=

0.01*1,000=10

(隨機(jī))

。7個(gè)上調(diào)基因，5個(gè)下調(diào)基因<

10，因此上例計(jì)算的結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。FDR必須遠(yuǎn)小于發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因數(shù)目。另一種常用基因芯片——寡核苷酸表達(dá)譜芯片的數(shù)據(jù)預(yù)處理：由于探針長度較短（20-25bp），采用匹配/失配探針對(duì)方法，即設(shè)計(jì)一個(gè)特異的寡核苷酸（

PM匹配）、同時(shí)設(shè)計(jì)一個(gè)非特異性的寡核苷酸探針（

MM失配），該探針僅僅在中間位置有一個(gè)堿基替換。用PM與MM之間的差值作為信號(hào)強(qiáng)度，來解決寡核苷酸之間非特異性雜交的噪聲影響。一般設(shè)計(jì)11-20對(duì)探針來檢測一個(gè)轉(zhuǎn)錄本。寡核苷酸芯片與cDNA芯片的數(shù)據(jù)預(yù)處理差別主要集中在轉(zhuǎn)錄表達(dá)值的獲取，即如何將11-20對(duì)探針值轉(zhuǎn)化為單個(gè)轉(zhuǎn)錄的表達(dá)值呢，常用三種預(yù)處理方法，即MAS、RAM法、MBEI法。MAS方法將芯片分為k（默認(rèn)值為16）個(gè)網(wǎng)格區(qū)域，用每個(gè)區(qū)域使用信號(hào)強(qiáng)度最低的2%探針去計(jì)算背景值和噪聲。R

M

A

,

該方法使用回旋(

convolution)