免疫溶血法檢測單個補體成分的活性

第十九章

補體檢測及應用1整理課件

第一節(jié)概述一、補體成分的含量與理化特性二、補體的活化途徑

第二節(jié)補體總活性測定

第三節(jié)單個補體成分的測定一、免疫溶血法二、免疫化學法2整理課件

第四節(jié)補體結(jié)合試驗一、試驗原理二、試驗方法三、方法評價

第五節(jié)補體受體的測定第六節(jié)補體測定的應用

思考題小結(jié)3整理課件第一節(jié)概述補體：具酶樣活性、不耐熱的糖蛋白其存在與抗原性異物的刺激無關在正常人血清中含量相對穩(wěn)定某些疾病時，含量及其活性可發(fā)生改變4整理課件分類一、補體成分的含量與理化特性根據(jù)補體系統(tǒng)的生物學功能，可將其分為：補體固有成分、補體調(diào)節(jié)蛋白、補體受體(complementreceptor,CR)三大局部。5整理課件補體理化性質(zhì)由肝細胞、巨噬細胞以及腸粘膜上皮細胞等多種細胞產(chǎn)生均為多糖蛋白，大多數(shù)電泳遷移率屬α、γ球蛋白含量約占血清球蛋白總量的10%，其中C3含量最高、D因子含量最低固有成份間的分子量差異較大，其中C1q最大、D因子最小。對熱不穩(wěn)定，56°C、30min即被滅活，0～10°C條件下活性只能保持3～4d。多種理化因素如射線、機械振蕩、酒精、膽汁和某些添加劑等均可破壞補體6整理課件補體成分分子量電泳區(qū)帶血清含量參考值（μg/ml）補體成分分子量電泳區(qū)帶血清含量參考值（μg/ml）C1q390γ270C979α240C1r95β35B95β210~240C1s85α35D25α2C2117β120~30P220γ225C3190β11300C1INH150α180C4180β2430~600C4bp1100250C5190β275I因子93β50C6128β260H因子159β400~480C7120β255S因子88α500C8163γ12007整理課件經(jīng)典途徑二、補體的活化途徑8整理課件9整理課件經(jīng)典激活途徑替代激活途徑MBL途徑激活物質(zhì)抗原抗體復合物肽聚糖、酵母多糖、脂多糖MBL相關的絲氨酸蛋白酶起始分子C1qC3C2、C4參與補體成分C1、C4、C2、C3、C5-C9C3、C5-C9、B因子、D因子C2-C9、MASP所需離子Ca2+、Mg2+Mg2+Ca2+C3轉(zhuǎn)化酶C4b2bC3bBbC4b2bC5轉(zhuǎn)化酶C4b2b3bC3bnBbC4b2b3b生物學作用參與特異性免疫的效應階段,感染后期發(fā)揮作用參與非特異性免疫的效應階段,感染早期發(fā)揮作用參與非特異性免疫的效應階段,感染早期發(fā)揮作用三種途徑比較10整理課件第二節(jié)補體總活性測定補體總活性測定方法是以紅細胞的溶解為指示，以50%溶血為判斷終點，稱為CH50補體活化途徑不同，應用不同的激活物可活化不同的補體途徑基于經(jīng)典途徑的CP-CH50〔臨床常規(guī)工程〕應用于C3旁路檢測的AP-CH50〔尚未列入檢驗常規(guī)〕MBL途徑活性測定的可靠方法暫未建立11整理課件〔一〕CH50測定法的原理應用綿羊紅細胞〔sheepredbloodcell,SRBC〕和其相應的抗體〔溶血素〕，作為能誘導補體活化經(jīng)典途徑的指示物和激活劑。補體能使溶血素特異性結(jié)合的綿羊紅細胞溶解，當溶血素和綿羊紅細胞濃度恒定時，溶血程度與補體含量和活性相關。將新鮮待檢血清作不同稀釋后，參加反響體系，測定溶血程度，以50%溶血時的最小血清用量作為判定終點，可測知補體總?cè)苎钚?2整理課件溶血程度與補體含量的關系

在適當、穩(wěn)定的反響系統(tǒng)中，溶血反響與補體的劑量依賴關系呈現(xiàn)“S〞形曲線在輕微溶血和接近完全溶血時，補體量的變化對溶血程度的影響不大，即溶血對補體量的依賴不敏感。但在30％～70%溶血時，補體含量僅出現(xiàn)較小的變動，溶血程度也會發(fā)生較大的改變13整理課件〔二〕CH50測定方法1.紅細胞濃度的調(diào)整綿羊紅細胞〔SRBC〕采自綿羊頸靜脈，制備脫纖維羊血或用阿氏〔Alsever〕血液保存液制成抗凝血，4℃保存?zhèn)溆?。使用前，調(diào)制成2%～5%SRBC懸液。為使紅細胞濃度標準化，可吸取少量紅細胞懸液，參加20～30倍的稀釋液，在542nm波長處測定吸光值以調(diào)整紅細胞濃度。14整理課件2.溶血素滴定溶血素可通過SRBC免疫家兔獲得，一般無需純化試驗前需先行加熱56℃30min或60℃3min以滅活補體溶血素有商品銷售，可按標識效價稀釋使用自行制備的溶血素需進行滴定，確定使用濃度，在補體活性測定中，大多使用2個單位。溶血素效價穩(wěn)定，一般使用3個月后再作重新滴定15整理課件

3.稀釋緩沖液

4.50%溶血標準管

5.50%溶血總補體值的計算16整理課件〔三〕方法評價與臨床意義方法簡便、快速，但敏感性低，補體的活性除與反響體積成反比外，還與反響所用的緩沖液、SRBC的數(shù)量以及反響溫度有關總補體活性的參考范圍為50～100U/mlCH50增高見于：急性炎癥、組織損傷、惡性腫瘤等CH50降低見于：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎和強直性脊柱炎、急性腎小球腎炎等17整理課件第三節(jié)

單個補體成分的測定常作為單個補體成分的檢測指標：C3、C4、C1q、B因子和C1酯酶抑制物等測定方法：免疫溶血法〔檢測單個補體成分的活性〕免疫化學法〔檢測單個補體成分的含量〕自動化免疫散射比濁法18整理課件一、免疫溶血法定義:是根據(jù)補體參與抗體介導溶細胞作用的級聯(lián)效應特征建立的單一補體成分檢測法指示系統(tǒng):以SRBC-抗SRBC為激活物和指示系統(tǒng)參照體系:以人為設計的缺乏某種補體成分的血清為參照結(jié)果判度:假設有溶血發(fā)生，說明待檢標本存在參照血清所缺乏的補體成分，且溶血程度與此補體成分的量呈正比，仍以50％溶血為終點19整理課件參照血清常稱之“R〔remove〕〞試劑，即去除某種補體成分之意。已能篩選到的血清有人C2缺乏、豚鼠C4缺乏、小鼠C5缺乏和家兔C6缺乏的血清免疫溶血法常用于C2、C3、C4、C5、C6等補體成分的檢測。其中以C3、C4兩成分的檢測更為常見20整理課件二、免疫化學法免疫化學法分類1.單向免疫擴散

2.火箭免疫電泳

3.透射比濁法

4.散射比濁法前兩種方法：手工操作繁瑣、耗時長、影響因素多、結(jié)果重復性差，已趨于淘汰后兩種方法：通過儀器對補體的C3、C4、B因子等單個成分進行自動化測定21整理課件比濁法比濁法原理借助補體的抗原性和與相應抗體反響的前帶現(xiàn)象建立的補體單個成分定量檢測法。比濁法缺乏必需以過量的某種補體相應抗體為保證自動免疫比濁法反映所測補體成分的絕對量可進行標準化流程管理與質(zhì)量控制22整理課件第四節(jié)

補體結(jié)合試驗補體結(jié)合試驗(complementfixationtest，CFT)將免疫溶血作為指示系統(tǒng)，用以檢測另一反響系統(tǒng)中抗原或抗體的傳統(tǒng)方法。23整理課件一、試驗原理作用原理：利用補體的溶細胞作用進行各種物理狀態(tài)的抗原抗體測定5種成分，3個系統(tǒng)反響系統(tǒng)：抗原〔或抗體〕與待測抗體〔或抗原〕補體系統(tǒng)指示系統(tǒng)：SRBC與相應溶血素。試驗時常將其預先結(jié)合，成為致敏綿羊紅細胞〔sensitizedsheepredbloodcell,SRBCS〕。24整理課件反響分兩步進行第一步:反響系統(tǒng)與補體的作用第二步:指示系統(tǒng)利用剩余補體的反響不溶血為補體結(jié)合試驗陽性，而溶血為試驗陰性25整理課件〔一〕.試劑的準備二、補體結(jié)合試驗方法1.抗原或抗體用于試驗的抗原或抗體:

需要純化純度愈高，特異性愈強抗原與抗體比例適當:

確定抗原或抗體相應的使用單位采用方陣或棋盤法進行抗原與抗體滴定26整理課件27整理課件血清標本遇有抗補表達象時，可作以下處理：加熱滅活時提高12℃－20℃凍融后離心去沉淀以3mmol/L鹽酸處理參加少量補體后再行滅活以白陶土處理通入CO2以小白鼠肝粉處理用含10％新鮮雞蛋清的生理鹽水稀釋血清3.待測標本采血并及時別離血清用于檢測或－20℃保存?zhèn)溆谩Ｔ囼炃?，應先將血?6℃加熱30min〔或60℃3min〕以滅活補體。28整理課件〔二〕正式試驗分類:小量法、微量法，以小量法常用實驗過程:稀釋和處理后的標本與抗原或抗體、不同含量的補體溫育與指示系統(tǒng)共育結(jié)果判度:對照管:陰性對照管:溶血陽性對照管:不溶血抗體或抗原對照管:完全溶血待檢血清對照管:完全溶血綿羊紅細胞對照管:不出現(xiàn)自發(fā)性溶血29整理課件補體對照管：受檢血清陽性:不溶血陰性:溶血注意:假設上述各對照管不出現(xiàn)預期結(jié)果，那么試驗結(jié)果不可靠，其可能原因應根據(jù)出錯的對照管進行分析。

2個單位:全溶1個單位:全溶或略帶少許紅細胞

0.5個單位:不發(fā)生溶血30整理課件三、方法評價優(yōu)點靈敏度高、所測定的抗體水平可達0.05μg/ml，出現(xiàn)交叉反響的機率較小，可檢測的抗原或抗體范圍廣泛，無需特殊設備、結(jié)果容易觀察、試驗條件要求不高現(xiàn)狀影響的因素多、各種制劑需要煩瑣的稀釋和滴定等，現(xiàn)代化、自動化抗原抗體檢測方法的不斷涌現(xiàn)，補體結(jié)合試驗逐漸被遺棄補體結(jié)合試驗作為一種經(jīng)典的免疫方法類型，其設計和原理仍對新型免疫方法的建立有著啟迪和指導作用31整理課件第五節(jié)補體受體的測定補體受體：存在于多種細胞去除免疫復合物、凈化機體內(nèi)環(huán)境檢測補體受體，有助于判斷機體抗感染能力和計數(shù)相應的細胞數(shù)量32整理課件補體受體目前的補體受體歸為以下五類：CR1〔CD35〕CR2〔CD21〕CR3〔CD11b/CD18〕CR4(gp150/95，CD11c/18)C3aR/C5aR33整理課件名稱別名CD分類配體細胞分布CR1C3b受體，C4B/C3b受體CD35iC3b、C3b，C4b、iC4b，C3c紅細胞、中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、B細胞、樹突狀細胞、腎小球上皮細胞CR2C3d受體，EB病毒受體CD21iC3b、C3dg、C3d、EB病毒、IFN-αB細胞、樹突狀細胞CR3iC3b受體、Mac-1抗原CD11b/CD18iC3b、植物凝集素、某些細胞多糖中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、NK細胞CR4gp150/95CD11C/CD18iC3b、C3d、C3dg中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、血小板C5aR/C3aRCD88C5a/C3a(活化G蛋白)內(nèi)皮細胞、肥大細胞、吞噬細胞補體受體特性34整理課件第六節(jié)補體測定的應用補體相關試驗：診斷梅毒螺旋體感染的華氏反響〔已淘汰〕HLA分型的補體依賴性細胞毒試驗抗原抗體檢測的脂質(zhì)體免疫試驗、免疫粘連血凝試驗抗體形成細胞定量檢測的溶血空白斑技術(shù)免疫復合物測定的膠固素結(jié)合試驗和C1q結(jié)合試驗35整理課件應用于補體含量和活性檢測的試驗

AP-CH50和AP-H50試驗:反映總補體活性

溶血試驗

免疫化學試驗

免疫熒光技術(shù)檢測補體單個成分及其裂解產(chǎn)物〔C1q、C3SP、C3、C4、B因子等〕和補體受體36整理課件(圖)血管神經(jīng)性水腫補體含量和活性相關的疾病1．免疫相關性疾?。喝缱陨砻庖咝约膊r，C1、C2、C3、C4和Hf等缺陷；超敏反響時〔III型超敏反響〕，C3a、C5a等過敏毒素的產(chǎn)生。2．與補體有關的遺傳性疾病：①C2、C3缺陷導致的嚴重感染；②與C1抑制物缺陷相關的遺傳性血管神經(jīng)性水腫③SLE患者出現(xiàn)的細胞外表CR1缺陷與C1C去除障礙④涉及I因子、H因子缺陷的腎小球腎炎；⑤DAF缺陷引起的陣發(fā)性血紅蛋白尿；⑥C1q缺陷表現(xiàn)的嚴重頑固性皮膚損害，以及C1q、C1r、C4、C2缺陷造成的免疫復合物性血管炎〔包括腎炎〕等。(圖)血管神經(jīng)性水腫37整理課件3．補體含量顯著降低的疾病：①消耗增多:免疫復合物形成導致的補體活化和消耗增多.如SLE.②補體的大量喪失:主要見于大面積燒傷、失血及腎臟病患者