玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究進展

.頁眉.PAGE頁腳..玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究進展摘要：植物遺傳轉(zhuǎn)化是指以植物器官、組織、細胞或原生質(zhì)體作為受體,通過某種技術或途徑轉(zhuǎn)入外源基因,獲得使外源基因穩(wěn)定表達的可育植株。玉米作為世界上主要三大糧食作物之一,是現(xiàn)代食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)和化學工業(yè)的重要原料,在世界經(jīng)濟乃至人類生存方面占據(jù)肴舉足輕重的地位，所以它的遺傳轉(zhuǎn)化研究一直受到各國科學家的重視，至今對玉米遺傳轉(zhuǎn)化的研究已經(jīng)取得了一些成績，本文主要針對近年來玉米遺傳轉(zhuǎn)化技術所取得的重要進展進行論述。主要包括玉米轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)、轉(zhuǎn)化方法及其優(yōu)點與存在的問題以及對未來的展望等幾方面論述玉米遺傳轉(zhuǎn)化的研究進展。關鍵詞：玉米；受體系統(tǒng)；遺傳轉(zhuǎn)化方法0前言近年來，隨著環(huán)境著人口、資源、環(huán)境三者之間矛盾的加劇，轉(zhuǎn)基因作物漸漸地進入人們的視野并且顯得極為重要。玉米是重要的糧食、飼料，同時還是制藥、淀粉、糖漿、油料、酒精工業(yè)的主要原料，在我國經(jīng)濟生產(chǎn)中占有非常重要的地位。所以玉米遺傳轉(zhuǎn)化的研究備受各國科學家的重視。自1988年Rhodes等首次獲得玉米轉(zhuǎn)基因完整植株以來，玉米遺傳轉(zhuǎn)化技術得到了較大的發(fā)展[1]。不但許多有價值的基因轉(zhuǎn)入玉米，而且轉(zhuǎn)基因方法也出現(xiàn)了多樣化，如基因槍法、農(nóng)桿菌介導法、花粉管通道法等。隨著轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展與完善，更多的優(yōu)良外源基因?qū)⒈挥糜谟衩椎倪z傳改良，并且為闡述單子葉植物基因表達調(diào)控機理提供了新方法。1玉米遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的研究1．1玉米基因轉(zhuǎn)化受體體系應具備的條件是：1高效穩(wěn)定的再生能力：用于植物基因轉(zhuǎn)化的外植體必須易于再生，有很高的再生頻率，并且具有穩(wěn)定性和重復性。根據(jù)賈士榮等報道認為，用于基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)應具有80%-90%以上的再生頻率，并且每塊外植體上必須再生叢生芽，其芽數(shù)量越多越好，這樣才有可能獲得較高頻率轉(zhuǎn)化。2較高的遺傳穩(wěn)定性：植物基因轉(zhuǎn)化是將外源基因?qū)胫参锊⑹怪?、表達和遺傳，從而達到修飾原有植物遺傳物質(zhì)、改造不良的園藝性狀之目的，這就要求植物受體系統(tǒng)接受外源DNA后應不影響其分裂和分化并能穩(wěn)定地將外源基因遺傳給后代，保持遺傳穩(wěn)定性，盡量減少變異。3具有穩(wěn)定的外植體來源：因為基因轉(zhuǎn)化的頻率很低，需要多次反復試驗，所以就需要大量的外植體材料，轉(zhuǎn)化的外植體一般采用無菌實生苗的子葉、胚軸、幼葉等或采用可快速繁殖的材料。4對選擇性抗生素敏感：在基因轉(zhuǎn)化中用于篩選轉(zhuǎn)化體的抗生素稱為選擇性抗生素，其使用就是要求植物受體材料對所選用的抗生素有一定的敏感性，即當添加在選擇培養(yǎng)基中的該抗生素達到一定濃度時能夠抑制非轉(zhuǎn)化體植物細胞的生長、發(fā)育和分化，而轉(zhuǎn)化的植物細胞由于攜帶該抗生素抗性基因而能正常生長、分裂和分化，最后獲得完整的轉(zhuǎn)化植株。5對農(nóng)桿菌侵染有敏感性但無過敏性反應：目前用作玉米遺傳轉(zhuǎn)化的材料多為A188、B73及其衍生系，或者是用其他玉米自交系配制的雜交組合。將外源基因?qū)脒@些材料后，尚需經(jīng)過大量的回交轉(zhuǎn)育工作才能將這些基因轉(zhuǎn)入有育種價值的玉米自交系。如果將有用基因轉(zhuǎn)入優(yōu)良玉米自交系中，經(jīng)分子檢測證明其整合和表達后，就有可能作為新系直接配制組合，在生產(chǎn)上利用，這將大大加快基因工程改良現(xiàn)有玉米品種的步伐。1998年，周逢勇通過基因槍法將Bt基因轉(zhuǎn)入玉米自交系P9-10并獲得表達，從而建立起這個自交系的遺傳轉(zhuǎn)化體系[2]。1、2玉米作為遺傳試驗材料的優(yōu)點1生長期較短，繁殖速度快.節(jié)約時間。

2具有多對容易區(qū)分的相對性狀。

3一次產(chǎn)生的后代多，產(chǎn)生的籽粒均在果穗上，容易準確統(tǒng)計。1．3玉米遺傳轉(zhuǎn)化常用受體1愈傷組織再生系統(tǒng)：外植體經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導出愈傷組織，再經(jīng)過分化培養(yǎng)獲得再生植株。2原生廈體再生系統(tǒng)：原生質(zhì)體作為受體系統(tǒng)可直接進行轉(zhuǎn)化，而且轉(zhuǎn)化率較高，嵌合體少。但是玉米的原生質(zhì)體分離較困難，培養(yǎng)周期長，再生頻率低，所以，目前已很少應用的較少。3種質(zhì)系統(tǒng)：種質(zhì)受體指轉(zhuǎn)基因利用的受體是植物自身的生殖系統(tǒng)，如花粉粒、卵細胞。4直接分化再生系統(tǒng)：直接分化指葉片、幼莖等外植體細胞越過脫分化產(chǎn)生愈傷組織而直接分化出不定芽獲得再生植株。李學紅等用玉米莖尖離體培養(yǎng)直接產(chǎn)生了雌雄花序[3]。2玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法通過特定的方式將外源基因?qū)氲绞荏w細胞內(nèi)，使之發(fā)生定向的、永久的變異，這是遺傳轉(zhuǎn)化中極其關鍵的步驟。迄今為止，玉米的遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有基因槍法、花粉管通道法、聚乙二醇介導法超聲波介導法電激法子房注射法陽離子轉(zhuǎn)化法以及于20世紀90年代出現(xiàn)的農(nóng)桿菌介導法。2．1基因槍法1987年，Comell大學的Sanford等人發(fā)明了火藥式基因槍法，利用高速運動的金屬離子將非特異的外源基因?qū)胧荏w內(nèi)；1989年Klein等首次獲得轉(zhuǎn)基因玉米，用基因槍法將GUS和PAT）基因引入玉米懸浮細胞系；1990年，Cordon-Kamm等用基因槍法將GUS和PAT）基因引入玉米懸浮細胞系，并且獲得可育的轉(zhuǎn)基因玉米植株[4].Vain等報道用基因槍轉(zhuǎn)化玉米胚性細胞時高滲和脫水處理可以提高轉(zhuǎn)化頻率Koziel用基因槍將GrvLA(b)導入了一個優(yōu)良玉米自交系的幼胚中，轉(zhuǎn)基因植株能高水平表達GrvLA(b)，在溫室和大田栽培中表現(xiàn)出很強的抗玉米螟的能力，且在后代中穩(wěn)定遺傳.Dupuis報道了以玉米幼雄穗為受體材料用基因槍轟擊法將GUS和花色素苷合成酶基因el或Peru轉(zhuǎn)化給玉米，并在35S啟動子驅(qū)動下在轟擊后24h在幼雄穗中獲得瞬時表達；1996年，Caimi用基因槍法將細菌的淀粉液化酶SacB基因轉(zhuǎn)入玉米愈傷組織，獲得可育轉(zhuǎn)化植株，且轉(zhuǎn)化基因能在子代中穩(wěn)定遺傳；1999年，李慧芬等用基因槍法成功地將Bt基因轉(zhuǎn)入了玉米優(yōu)良自交系F28，并研究了選擇次數(shù)對轉(zhuǎn)化效率的影響[5]。張秀君等構(gòu)建了兩個含高賴氨酸蛋白質(zhì)基因cDNA的表達載體，用基因槍法將其導入玉米不同雜交組合的胚性愈傷組織，通過潮霉素篩選，經(jīng)Southern雜交檢測得到了轉(zhuǎn)基因植株[6]。2000年，劉大文等將Z·Zm13-Barnase基因轉(zhuǎn)化經(jīng)高滲處理的Q31×Z3、Z31×Q31玉米胚性愈傷組織，經(jīng)過6輪的除草劑篩選獲得32塊抗性愈傷組織，再生得到24個植株；Southemblot分析證明。其中5個植株中整合有Barnse基因[7]?；驑尫ㄊ怯衩走z傳轉(zhuǎn)化的主要方法，基因槍法不受基因型的限制，但是外源基因整合的拷貝數(shù)多，且受體組織的類型對基因槍的轉(zhuǎn)化有影響，有潛在分化能力的細胞的轉(zhuǎn)化率高。2．2花粉管通道法花粉管通道法,是在植物整體水平進行目的基因DNA片段的導人，直接獲得轉(zhuǎn)化種子，通過后代的篩選獲得帶有目的基因的片段。1978(年,中國科學家周光宇先生首創(chuàng)并推廣了花粉管通道法，他首先應用花粉管通道法在棉花基因轉(zhuǎn)移上取得成功。1996年，楊利國等利用此花粉管通道法將廣譜無毒抗病基因PYH157轉(zhuǎn)入玉米自交系。由于玉米的花柱比較長，在外源DNA導入前必須對果穗進行整理，滴入的DNA溶液量一定要充分，一般每穗0．5～1．0mL，滴人的次數(shù)也可隨時間段的不同分別滴人，每次滴入的量要足，這樣可以充分提高轉(zhuǎn)化效率和試驗的準確性。在授粉后18—26h的不同時間段來進行導人，導入時間以早晨4分鐘左右為最好[8]?；ǚ酃芡ǖ婪ǖ膬?yōu)點在于：可向玉米導入目的基因，也可轉(zhuǎn)移含目的基因性狀的供體總DNA。這對于目前玉米大多數(shù)農(nóng)藝性狀基因還沒有完全分離出來的現(xiàn)狀具有重要的現(xiàn)實意義。且簡便易學。2．3聚乙二醇法1993年，Golovkin等用PEG法將H89的原生質(zhì)體分別與含有CaMV35S啟動子和鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)突變基因(氨甲喋呤抗性)的質(zhì)粒pMP和pDMP共培養(yǎng)，其中pDMP的re&fir基因插入了玉米Dsl轉(zhuǎn)座子，用氨甲喋呤篩選得到抗性愈傷組織，在不含激素的培養(yǎng)基上再生出植株。Omimlleh等用PEG法將外源基因?qū)说接蒆E89的懸浮細胞系分離得到的原生質(zhì)體，建立了植株再生的轉(zhuǎn)化體系。PEG法轉(zhuǎn)化效牢較高，但必須以裸露的原生質(zhì)體為受體，而且還受到基因型的限制。2．4超聲波法1997年，張宏等首次用超聲波法將Bt基因轉(zhuǎn)入玉米，并獲得了可育的轉(zhuǎn)基因植株及其后代。超聲波法能獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，但操作繁瑣，而且載體DNA在超聲波處理過程中容易斷裂。1997年，張宏等首次用超聲波法將Bt基因轉(zhuǎn)入玉米，并獲得了可育的轉(zhuǎn)基因植株及其后代。2．5電激法利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)膜上“電激穿孔”，形成可逆的瞬間通道，從而促進對外源基因的提取。柯遐義等利用自制的脈沖式放電電激儀，以具有再生能力的玉米幼胚作受體，成功地將外源基因?qū)擞衩椎挠着呒毎@得轉(zhuǎn)基因植株[6]。Fromm等(1985)用電激法將pat基因?qū)肆擞衩自|(zhì)體，得到了該基因穩(wěn)定表達的愈傷組織。隨著玉米原生質(zhì)體再生技術的研究取得進展，1988年，Rhodes等用電激法轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體，首次獲得了完整的轉(zhuǎn)基因植株。電激法還可以對幼胚、愈傷組織和胚性懸浮細胞系進行遺傳轉(zhuǎn)化。電激法操作簡單，不受宿主限制，在玉米遺傳轉(zhuǎn)化技術研究的初期得到了較為廣泛的應用，但是它的轉(zhuǎn)化效率較低，而且對有壁細胞或組織的轉(zhuǎn)化效果較差。2．6子房注射法子房注射法是指利用顯微注射儀或微注射針把外源DNA溶液注入子房中，靠子房產(chǎn)生的壓力及卵細胞的吸收使外源DNA進入受精的卵細胞中。1993年，丁群星等在國內(nèi)外首次報道了使用子房注射法轉(zhuǎn)化玉米,用微玻針將Bt毒蛋白基因?qū)胗衩鬃越幌底蚜?，最后獲得一株轉(zhuǎn)基因玉米[9]。雖然這些方法不需要建立再生體系．而且可繞過原生質(zhì)體或組織培養(yǎng)的過程，能直接得到種子,但轉(zhuǎn)化頻率過低。2001年，沈世華等利用離體子房注射法轉(zhuǎn)化普通玉米獲得成功，比非離體轉(zhuǎn)化效率有所提高[10]。該方法轉(zhuǎn)化率不高,影響轉(zhuǎn)化效率和結(jié)實率的原因是子房經(jīng)注射受害較深而導致敗育。應改進注射技術和注射工具，盡量減輕對子房的傷害，提高注射的準確度，并且DNA和注射工具均不能帶菌。雖然該方法有缺點，但是仍然具有優(yōu)勢，經(jīng)過進一步的研究探索，它將成為玉米基因轉(zhuǎn)化的一個重要方法。2．7陽離子轉(zhuǎn)化法陽離子轉(zhuǎn)化法是一種帶正電荷的脂質(zhì)體作載體攜帶外源基因，與帶負電荷的細胞膜融合，把外源基因?qū)胧荏w細胞。該方法以原生質(zhì)體為受體材料。有許多研究表明，外源基因被導入原生質(zhì)體在細胞中能瞬時表達，并且在其再生愈傷組織中穩(wěn)定整合和表達，但是由此獲得的轉(zhuǎn)基因可育植株卻很少。玉米原生質(zhì)體再生植株強烈地依賴于基因型，僅有少數(shù)幾例對生產(chǎn)價值不大的品系如A188等能再生植株，無法應用于許多栽培品系或品種，因此此轉(zhuǎn)化方法受到很大限制。2．8農(nóng)桿菌介導法農(nóng)桿菌介導法是利用根癌農(nóng)桿菌所含Ti質(zhì)粒將外源DNA序列轉(zhuǎn)入植物受體細胞。1999年，黃璐等報道了用根癌農(nóng)桿菌介導的方法轉(zhuǎn)化玉米栽培品種，獲得轉(zhuǎn)化植株,并對轉(zhuǎn)化的愈傷組織中沉默的外源基因的甲基化現(xiàn)象進行了分析[11]。2001年，張榮等用含超雙元載體和普通雙元載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米幼胚，產(chǎn)生抗性愈傷率分別為29%和22%。2002年，張艷貞等用農(nóng)桿菌介導法將BT殺蟲基因?qū)雰?yōu)良玉米自交系，以丹340、4112為材料，用帶有質(zhì)粒PGBIL04的根癌農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化幼胚及其初始愈傷組織，獲得再生植株，經(jīng)PCR檢測證明目的基因已經(jīng)整合到再生植株的基因組中[12]。雖然農(nóng)桿菌作為一種天然的植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，具有轉(zhuǎn)化的外源DNA結(jié)構(gòu)完整、轉(zhuǎn)化機理清楚、整合位點較穩(wěn)定、拷貝數(shù)低、整合后的外源基因結(jié)構(gòu)變異較小等優(yōu)點，但是農(nóng)桿菌介導玉米轉(zhuǎn)化中的主要問題是大多數(shù)玉米育種骨干自交系轉(zhuǎn)化頻率低。農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化玉米是一個復雜過程，受農(nóng)桿菌、玉米受體及培養(yǎng)環(huán)境等多方面各種相互作用因素的影響，所以該方法還有待于進一步的完善。3小結(jié)在數(shù)十年內(nèi)，玉米遺傳轉(zhuǎn)化有了突破性的進展，玉米的轉(zhuǎn)基因受體材料越來越廣泛，轉(zhuǎn)化方法也日趨完善。如今，利用基因槍轉(zhuǎn)化技術獲得的抗蟲、抗除草劑的轉(zhuǎn)基因玉米已應用于商品化生產(chǎn)，基因槍法不受基因型的限制，但是外源基因整合的拷貝數(shù)多，且受體組織的類型對基因槍的轉(zhuǎn)化有影響，有潛在分化能力的細胞的轉(zhuǎn)化率高，而且價格昂貴；PEG法轉(zhuǎn)化效率高，但必須以裸露的原生質(zhì)體為受體，而玉米原生質(zhì)體的游離比較困難，同時還受到基因型的限制：電激法操作簡單，不受宿主限制，但是轉(zhuǎn)化效率較低；子房注射法的轉(zhuǎn)化率不高，但是仍然具有優(yōu)勢，值得深入研究；陽離子轉(zhuǎn)化法獲得可育的轉(zhuǎn)基因植株少，因此，該法受到限制：農(nóng)桿菌介導法可轉(zhuǎn)移相對較大的DNA片段，獲得較多的單拷貝轉(zhuǎn)基因植株．轉(zhuǎn)化效率高，但對有壁細胞或組織的轉(zhuǎn)化效果較差，而且。單子葉植物不能作農(nóng)桿菌的受體。總而言之，每種方法都不是無懈可擊的，都存在缺點，都需要加以完善，必要時，可以嘗試將多種方法綜合到一起使用，以達到取長不淡的目的。4展望在未來的研究工作中，要加強對各種技術措施的完善，建立完善的各特定基因型的遺傳轉(zhuǎn)化技術體系，降低了工作量和難度等。我認為，從目前的形勢看，農(nóng)桿菌介導法已成為玉米也遺傳轉(zhuǎn)化的一種主流方式，所以在完善其他方法的同時，可以著重于對農(nóng)桿菌介導法的研究，克服各種限制因素、降低成本、提高效率，建立完善的遺傳轉(zhuǎn)化體系，提高玉米的遺傳轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定性，從而獲得更大的效益參考文獻：[1]RhodesCA，PierceDA，MettlesU，etalGeneticallytransformedmaizeplantsfromprotoplastsScirnce，1988，240:204-217［2］周逢勇,王國英,郭三堆,等.玉米自交系P9-10遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立［J］.科學通報,1998,43（23）:25117-2521［3］李學紅,張舉仁.玉米莖尖離體培養(yǎng)直接產(chǎn)生雌旌花亭的研究[J].中國科學,1999,29(2)：186—193[4]Cordon-KammWJ,SpencerTM,Mangano