玉米遺傳轉化體系的研究進展

.頁眉.PAGE頁腳..玉米遺傳轉化體系的研究進展摘要：植物遺傳轉化是指以植物器官、組織、細胞或原生質體作為受體,通過某種技術或途徑轉入外源基因,獲得使外源基因穩(wěn)定表達的可育植株。玉米作為世界上主要三大糧食作物之一,是現(xiàn)代食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)和化學工業(yè)的重要原料,在世界經(jīng)濟乃至人類生存方面占據(jù)肴舉足輕重的地位，所以它的遺傳轉化研究一直受到各國科學家的重視，至今對玉米遺傳轉化的研究已經(jīng)取得了一些成績，本文主要針對近年來玉米遺傳轉化技術所取得的重要進展進行論述。主要包括玉米轉化受體系統(tǒng)、轉化方法及其優(yōu)點與存在的問題以及對未來的展望等幾方面論述玉米遺傳轉化的研究進展。關鍵詞：玉米；受體系統(tǒng)；遺傳轉化方法0前言近年來，隨著環(huán)境著人口、資源、環(huán)境三者之間矛盾的加劇，轉基因作物漸漸地進入人們的視野并且顯得極為重要。玉米是重要的糧食、飼料，同時還是制藥、淀粉、糖漿、油料、酒精工業(yè)的主要原料，在我國經(jīng)濟生產(chǎn)中占有非常重要的地位。所以玉米遺傳轉化的研究備受各國科學家的重視。自1988年Rhodes等首次獲得玉米轉基因完整植株以來，玉米遺傳轉化技術得到了較大的發(fā)展[1]。不但許多有價值的基因轉入玉米，而且轉基因方法也出現(xiàn)了多樣化，如基因槍法、農(nóng)桿菌介導法、花粉管通道法等。隨著轉基因技術的發(fā)展與完善，更多的優(yōu)良外源基因將被用于玉米的遺傳改良，并且為闡述單子葉植物基因表達調控機理提供了新方法。1玉米遺傳轉化受體系統(tǒng)的研究1．1玉米基因轉化受體體系應具備的條件是：1高效穩(wěn)定的再生能力：用于植物基因轉化的外植體必須易于再生，有很高的再生頻率，并且具有穩(wěn)定性和重復性。根據(jù)賈士榮等報道認為，用于基因轉化的受體系統(tǒng)應具有80%-90%以上的再生頻率，并且每塊外植體上必須再生叢生芽，其芽數(shù)量越多越好，這樣才有可能獲得較高頻率轉化。2較高的遺傳穩(wěn)定性：植物基因轉化是將外源基因導入植物并使之整合、表達和遺傳，從而達到修飾原有植物遺傳物質、改造不良的園藝性狀之目的，這就要求植物受體系統(tǒng)接受外源DNA后應不影響其分裂和分化并能穩(wěn)定地將外源基因遺傳給后代，保持遺傳穩(wěn)定性，盡量減少變異。3具有穩(wěn)定的外植體來源：因為基因轉化的頻率很低，需要多次反復試驗，所以就需要大量的外植體材料，轉化的外植體一般采用無菌實生苗的子葉、胚軸、幼葉等或采用可快速繁殖的材料。4對選擇性抗生素敏感：在基因轉化中用于篩選轉化體的抗生素稱為選擇性抗生素，其使用就是要求植物受體材料對所選用的抗生素有一定的敏感性，即當添加在選擇培養(yǎng)基中的該抗生素達到一定濃度時能夠抑制非轉化體植物細胞的生長、發(fā)育和分化，而轉化的植物細胞由于攜帶該抗生素抗性基因而能正常生長、分裂和分化，最后獲得完整的轉化植株。5對農(nóng)桿菌侵染有敏感性但無過敏性反應：目前用作玉米遺傳轉化的材料多為A188、B73及其衍生系，或者是用其他玉米自交系配制的雜交組合。將外源基因導入這些材料后，尚需經(jīng)過大量的回交轉育工作才能將這些基因轉入有育種價值的玉米自交系。如果將有用基因轉入優(yōu)良玉米自交系中，經(jīng)分子檢測證明其整合和表達后，就有可能作為新系直接配制組合，在生產(chǎn)上利用，這將大大加快基因工程改良現(xiàn)有玉米品種的步伐。1998年，周逢勇通過基因槍法將Bt基因轉入玉米自交系P9-10并獲得表達，從而建立起這個自交系的遺傳轉化體系[2]。1、2玉米作為遺傳試驗材料的優(yōu)點1生長期較短，繁殖速度快.節(jié)約時間。

2具有多對容易區(qū)分的相對性狀。

3一次產(chǎn)生的后代多，產(chǎn)生的籽粒均在果穗上，容易準確統(tǒng)計。1．3玉米遺傳轉化常用受體1愈傷組織再生系統(tǒng)：外植體經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導出愈傷組織，再經(jīng)過分化培養(yǎng)獲得再生植株。2原生廈體再生系統(tǒng)：原生質體作為受體系統(tǒng)可直接進行轉化，而且轉化率較高，嵌合體少。但是玉米的原生質體分離較困難，培養(yǎng)周期長，再生頻率低，所以，目前已很少應用的較少。3種質系統(tǒng)：種質受體指轉基因利用的受體是植物自身的生殖系統(tǒng)，如花粉粒、卵細胞。4直接分化再生系統(tǒng)：直接分化指葉片、幼莖等外植體細胞越過脫分化產(chǎn)生愈傷組織而直接分化出不定芽獲得再生植株。李學紅等用玉米莖尖離體培養(yǎng)直接產(chǎn)生了雌雄花序[3]。2玉米遺傳轉化的方法通過特定的方式將外源基因導入到受體細胞內(nèi)，使之發(fā)生定向的、永久的變異，這是遺傳轉化中極其關鍵的步驟。迄今為止，玉米的遺傳轉化的方法主要有基因槍法、花粉管通道法、聚乙二醇介導法超聲波介導法電激法子房注射法陽離子轉化法以及于20世紀90年代出現(xiàn)的農(nóng)桿菌介導法。2．1基因槍法1987年，Comell大學的Sanford等人發(fā)明了火藥式基因槍法，利用高速運動的金屬離子將非特異的外源基因導入受體內(nèi)；1989年Klein等首次獲得轉基因玉米，用基因槍法將GUS和PAT）基因引入玉米懸浮細胞系；1990年，Cordon-Kamm等用基因槍法將GUS和PAT）基因引入玉米懸浮細胞系，并且獲得可育的轉基因玉米植株[4].Vain等報道用基因槍轉化玉米胚性細胞時高滲和脫水處理可以提高轉化頻率Koziel用基因槍將GrvLA(b)導入了一個優(yōu)良玉米自交系的幼胚中，轉基因植株能高水平表達GrvLA(b)，在溫室和大田栽培中表現(xiàn)出很強的抗玉米螟的能力，且在后代中穩(wěn)定遺傳.Dupuis報道了以玉米幼雄穗為受體材料用基因槍轟擊法將GUS和花色素苷合成酶基因el或Peru轉化給玉米，并在35S啟動子驅動下在轟擊后24h在幼雄穗中獲得瞬時表達；1996年，Caimi用基因槍法將細菌的淀粉液化酶SacB基因轉入玉米愈傷組織，獲得可育轉化植株，且轉化基因能在子代中穩(wěn)定遺傳；1999年，李慧芬等用基因槍法成功地將Bt基因轉入了玉米優(yōu)良自交系F28，并研究了選擇次數(shù)對轉化效率的影響[5]。張秀君等構建了兩個含高賴氨酸蛋白質基因cDNA的表達載體，用基因槍法將其導入玉米不同雜交組合的胚性愈傷組織，通過潮霉素篩選，經(jīng)Southern雜交檢測得到了轉基因植株[6]。2000年，劉大文等將Z·Zm13-Barnase基因轉化經(jīng)高滲處理的Q31×Z3、Z31×Q31玉米胚性愈傷組織，經(jīng)過6輪的除草劑篩選獲得32塊抗性愈傷組織，再生得到24個植株；Southemblot分析證明。其中5個植株中整合有Barnse基因[7]?；驑尫ㄊ怯衩走z傳轉化的主要方法，基因槍法不受基因型的限制，但是外源基因整合的拷貝數(shù)多，且受體組織的類型對基因槍的轉化有影響，有潛在分化能力的細胞的轉化率高。2．2花粉管通道法花粉管通道法,是在植物整體水平進行目的基因DNA片段的導人，直接獲得轉化種子，通過后代的篩選獲得帶有目的基因的片段。1978(年,中國科學家周光宇先生首創(chuàng)并推廣了花粉管通道法，他首先應用花粉管通道法在棉花基因轉移上取得成功。1996年，楊利國等利用此花粉管通道法將廣譜無毒抗病基因PYH157轉入玉米自交系。由于玉米的花柱比較長，在外源DNA導入前必須對果穗進行整理，滴入的DNA溶液量一定要充分，一般每穗0．5～1．0mL，滴人的次數(shù)也可隨時間段的不同分別滴人，每次滴入的量要足，這樣可以充分提高轉化效率和試驗的準確性。在授粉后18—26h的不同時間段來進行導人，導入時間以早晨4分鐘左右為最好[8]。花粉管通道法的優(yōu)點在于：可向玉米導入目的基因，也可轉移含目的基因性狀的供體總DNA。這對于目前玉米大多數(shù)農(nóng)藝性狀基因還沒有完全分離出來的現(xiàn)狀具有重要的現(xiàn)實意義。且簡便易學。2．3聚乙二醇法1993年，Golovkin等用PEG法將H89的原生質體分別與含有CaMV35S啟動子和鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)突變基因(氨甲喋呤抗性)的質粒pMP和pDMP共培養(yǎng)，其中pDMP的re&fir基因插入了玉米Dsl轉座子，用氨甲喋呤篩選得到抗性愈傷組織，在不含激素的培養(yǎng)基上再生出植株。Omimlleh等用PEG法將外源基因導人到由HE89的懸浮細胞系分離得到的原生質體，建立了植株再生的轉化體系。PEG法轉化效牢較高，但必須以裸露的原生質體為受體，而且還受到基因型的限制。2．4超聲波法1997年，張宏等首次用超聲波法將Bt基因轉入玉米，并獲得了可育的轉基因植株及其后代。超聲波法能獲得較高的轉化效率，但操作繁瑣，而且載體DNA在超聲波處理過程中容易斷裂。1997年，張宏等首次用超聲波法將Bt基因轉入玉米，并獲得了可育的轉基因植株及其后代。2．5電激法利用高壓電脈沖作用，在原生質膜上“電激穿孔”，形成可逆的瞬間通道，從而促進對外源基因的提取。柯遐義等利用自制的脈沖式放電電激儀，以具有再生能力的玉米幼胚作受體，成功地將外源基因導人玉米的幼胚細胞并獲得轉基因植株[6]。Fromm等(1985)用電激法將pat基因導人了玉米原生質體，得到了該基因穩(wěn)定表達的愈傷組織。隨著玉米原生質體再生技術的研究取得進展，1988年，Rhodes等用電激法轉化玉米原生質體，首次獲得了完整的轉基因植株。電激法還可以對幼胚、愈傷組織和胚性懸浮細胞系進行遺傳轉化。電激法操作簡單，不受宿主限制，在玉米遺傳轉化技術研究的初期得到了較為廣泛的應用，但是它的轉化效率較低，而且對有壁細胞或組織的轉化效果較差。2．6子房注射法子房注射法是指利用顯微注射儀或微注射針把外源DNA溶液注入子房中，靠子房產(chǎn)生的壓力及卵細胞的吸收使外源DNA進入受精的卵細胞中。1993年，丁群星等在國內(nèi)外首次報道了使用子房注射法轉化玉米,用微玻針將Bt毒蛋白基因導入玉米自交系籽粒，最后獲得一株轉基因玉米[9]。雖然這些方法不需要建立再生體系．而且可繞過原生質體或組織培養(yǎng)的過程，能直接得到種子,但轉化頻率過低。2001年，沈世華等利用離體子房注射法轉化普通玉米獲得成功，比非離體轉化效率有所提高[10]。該方法轉化率不高,影響轉化效率和結實率的原因是子房經(jīng)注射受害較深而導致敗育。應改進注射技術和注射工具，盡量減輕對子房的傷害，提高注射的準確度，并且DNA和注射工具均不能帶菌。雖然該方法有缺點，但是仍然具有優(yōu)勢，經(jīng)過進一步的研究探索，它將成為玉米基因轉化的一個重要方法。2．7陽離子轉化法陽離子轉化法是一種帶正電荷的脂質體作載體攜帶外源基因，與帶負電荷的細胞膜融合，把外源基因導入受體細胞。該方法以原生質體為受體材料。有許多研究表明，外源基因被導入原生質體在細胞中能瞬時表達，并且在其再生愈傷組織中穩(wěn)定整合和表達，但是由此獲得的轉基因可育植株卻很少。玉米原生質體再生植株強烈地依賴于基因型，僅有少數(shù)幾例對生產(chǎn)價值不大的品系如A188等能再生植株，無法應用于許多栽培品系或品種，因此此轉化方法受到很大限制。2．8農(nóng)桿菌介導法農(nóng)桿菌介導法是利用根癌農(nóng)桿菌所含Ti質粒將外源DNA序列轉入植物受體細胞。1999年，黃璐等報道了用根癌農(nóng)桿菌介導的方法轉化玉米栽培品種，獲得轉化植株,并對轉化的愈傷組織中沉默的外源基因的甲基化現(xiàn)象進行了分析[11]。2001年，張榮等用含超雙元載體和普通雙元載體的農(nóng)桿菌轉化玉米幼胚，產(chǎn)生抗性愈傷率分別為29%和22%。2002年，張艷貞等用農(nóng)桿菌介導法將BT殺蟲基因導入優(yōu)良玉米自交系，以丹340、4112為材料，用帶有質粒PGBIL04的根癌農(nóng)桿菌LBA4404轉化幼胚及其初始愈傷組織，獲得再生植株，經(jīng)PCR檢測證明目的基因已經(jīng)整合到再生植株的基因組中[12]。雖然農(nóng)桿菌作為一種天然的植物基因轉化系統(tǒng)，具有轉化的外源DNA結構完整、轉化機理清楚、整合位點較穩(wěn)定、拷貝數(shù)低、整合后的外源基因結構變異較小等優(yōu)點，但是農(nóng)桿菌介導玉米轉化中的主要問題是大多數(shù)玉米育種骨干自交系轉化頻率低。農(nóng)桿菌介導轉化玉米是一個復雜過程，受農(nóng)桿菌、玉米受體及培養(yǎng)環(huán)境等多方面各種相互作用因素的影響，所以該方法還有待于進一步的完善。3小結在數(shù)十年內(nèi)，玉米遺傳轉化有了突破性的進展，玉米的轉基因受體材料越來越廣泛，轉化方法也日趨完善。如今，利用基因槍轉化技術獲得的抗蟲、抗除草劑的轉基因玉米已應用于商品化生產(chǎn)，基因槍法不受基因型的限制，但是外源基因整合的拷貝數(shù)多，且受體組織的類型對基因槍的轉化有影響，有潛在分化能力的細胞的轉化率高，而且價格昂貴；PEG法轉化效率高，但必須以裸露的原生質體為受體，而玉米原生質體的游離比較困難，同時還受到基因型的限制：電激法操作簡單，不受宿主限制，但是轉化效率較低；子房注射法的轉化率不高，但是仍然具有優(yōu)勢，值得深入研究；陽離子轉化法獲得可育的轉基因植株少，因此，該法受到限制：農(nóng)桿菌介導法可轉移相對較大的DNA片段，獲得較多的單拷貝轉基因植株．轉化效率高，但對有壁細胞或組織的轉化效果較差，而且。單子葉植物不能作農(nóng)桿菌的受體?？偠灾糠N方法都不是無懈可擊的，都存在缺點，都需要加以完善，必要時，可以嘗試將多種方法綜合到一起使用，以達到取長不淡的目的。4展望在未來的研究工作中，要加強對各種技術措施的完善，建立完善的各特定基因型的遺傳轉化技術體系，降低了工作量和難度等。我認為，從目前的形勢看，農(nóng)桿菌介導法已成為玉米也遺傳轉化的一種主流方式，所以在完善其他方法的同時，可以著重于對農(nóng)桿菌介導法的研究，克服各種限制因素、降低成本、提高效率，建立完善的遺傳轉化體系，提高玉米的遺傳轉化效率和穩(wěn)定性，從而獲得更大的效益參考文獻：[1]RhodesCA，PierceDA，MettlesU，etalGeneticallytransformedmaizeplantsfromprotoplastsScirnce，1988，240:204-217［2］周逢勇,王國英,郭三堆,等.玉米自交系P9-10遺傳轉化體系的建立［J］.科學通報,1998,43（23）:25117-2521［3］李學紅,張舉仁.玉米莖尖離體培養(yǎng)直接產(chǎn)生雌旌花亭的研究[J].中國科學,1999,29(2)：186—193[4]Cordon-KammWJ,SpencerTM,Mangano