墊狀卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因(SpTPS1)的克隆及其功能分析的開題報(bào)告

墊狀卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因(SpTPS1)的克隆及其功能分析的開題報(bào)告開題報(bào)告一、研究背景與意義卷柏（Saccharinajaponica）是我國沿海地區(qū)的一種重要經(jīng)濟(jì)海藻，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和廣泛的醫(yī)藥功能。其中海藻糖作為卷柏海藻的主要低聚糖之一，在保護(hù)細(xì)胞膜和加強(qiáng)植物或藻類抗逆性等方面具有重要作用。目前，海藻糖的生物合成途徑仍在探索中，其中磷酸基團(tuán)的加入是關(guān)鍵步驟之一。墊狀卷柏在海藻糖合成中所扮演的角色尚未明確，因此本研究將利用PCR技術(shù)克隆墊狀卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因（SpTPS1），并進(jìn)行其生化特性和功能分析。二、研究內(nèi)容1.克隆墊狀卷柏SpTPS1基因根據(jù)已有卷柏海藻糖合成酶基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR技術(shù)從墊狀卷柏的全長cDNA庫中克隆SpTPS1基因，鑒定PCR產(chǎn)物的完整性和準(zhǔn)確性。2.生化特性鑒定構(gòu)建表達(dá)載體及在大腸桿菌中過表達(dá)SpTPS1基因，進(jìn)行一系列生化特性鑒定實(shí)驗(yàn)，包括酶活測定，反應(yīng)物特異性及受體模擬等。3.功能鑒定通過RNAi技術(shù)降低SpTPS1基因表達(dá)，同時(shí)測定轉(zhuǎn)基因墊狀卷柏中海藻糖的含量變化，進(jìn)一步探究SpTPS1基因在墊狀卷柏海藻糖合成過程中的功能作用。三、研究方法與技術(shù)路線1.基因克隆：根據(jù)已有海藻糖合成酶基因的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR技術(shù)從墊狀卷柏的cDNA庫中克隆SpTPS1基因。2.表達(dá)載體構(gòu)建：將克隆的SpTPS1基因連接至表達(dá)載體pET32a(+)，經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割、連接等操作制備表達(dá)載體。3.蛋白表達(dá)及純化：轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，利用給定條件獲得最佳表達(dá)結(jié)果。采用Ni-NTA柱純化組蛋白。4.酶活測定：采用反硫代糖膽酸（GSH）-紫外檢測法測定SpTPS1基因編碼的蛋白酶活。5.分子生物學(xué)鑒定：對SpTPS1基因編碼的蛋白進(jìn)行SDS和Westernblot鑒定，并進(jìn)行其分子量和特異性驗(yàn)證。6.RNAi敲除：在轉(zhuǎn)基因墊狀卷柏中利用RNAi技術(shù)降低SpTPS1基因表達(dá)，并檢測海藻糖含量變化情況，驗(yàn)證SpTPS1基因在墊狀卷柏海藻糖合成作用中的功能作用。四、研究預(yù)期結(jié)果1.成功克隆墊狀卷柏SpTPS1基因，鑒定PCR產(chǎn)物的完整性和準(zhǔn)確性。2.成功表達(dá)SpTPS1基因并鑒定其特異性。3.對SpTPS1基因編碼的蛋白進(jìn)行酶活測定及生化特性分析。4.RNAi敲除SpTPS1基因，并確定其在墊狀卷柏海藻糖合成作用中的功能作用。五、研究意義1.系統(tǒng)掌握墊狀卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆和生化特性，進(jìn)一步了解海藻糖合成途徑。2.為提高墊狀卷柏中海藻糖含量、改