基因診斷-病原學(xué)

基因診斷

—病原學(xué)中的原理及應(yīng)用

byPBL31、簡介2、原理3、特點4、應(yīng)用5、發(fā)展6、局限基因診斷

—利用分子生物學(xué)技術(shù)，

-從DNA/RNA水平檢測基因的存在

-分析基因的結(jié)構(gòu)變異和表達狀態(tài)

-對疾病作出診斷核酸分子雜交PCR擴增DNA序列測定DNA芯片技術(shù)病原體（pathogens）能引起疾病的微生物和寄生蟲的統(tǒng)稱。微生物占絕大多數(shù)，包括病毒、衣原體、立克次體、支原體、細菌、螺旋體和真菌；寄生蟲主要有原蟲和嚅蟲。什么是病原體基因診斷？病原體的基因診斷：針對病原體自身特異性核酸（DNA或RNA）序列，通過分子雜交和基因擴增等手段，鑒定和發(fā)現(xiàn)這些外源性基因組、基因或基因片段在人體組織中的存在，從而證實病原體的感染。2、原理-分子生物學(xué)技術(shù)：分子雜交：檢測特定序列

PCR：擴增外源性DNA

DNA測序-病原體檢測方法用已知核酸探針確定單鏈核酸堿基序列的技術(shù)。Southern印記雜交Northern印記雜交斑點雜交原位雜交分子雜交（molecularhybridization）probeprobe在有核糖體的病原體中：rRNA數(shù)量>>DNA故直接測定核糖體RNAPCR擴增1.不同種的微生物的DNA分子有可變區(qū)（綠色）和保守區(qū)（紅色）這是一段病原體DNA的示意圖2.不同菌種間高度可變區(qū)是鑒別證據(jù)可變區(qū)兩端具有保守序列3.根據(jù)此保守序列，設(shè)計廣譜PCR引物擴增的片段，對高變區(qū)擴增primer1primer24.引物擴增的片段經(jīng)測序，并與基因庫中序列比較就可得出待測細菌的菌種一些病原體檢測方法(一)直接顯微鏡檢查(二)病原體分離、培養(yǎng)和鑒定局限：適用于無菌，靈敏度低，分辨率低，耗時局限：適用于易培養(yǎng)的微生物，耗時(三)病原體抗原檢測抗原抗體抗原抗體S局限：昂貴，存在正常菌時的交叉反應(yīng)需對照(四)病原體抗體檢測抗原抗體抗原抗體S局限：敏感性（陰性值）特異性（陽性值）難定·主要技術(shù)為PCR

-高度特異性-高度敏感性

-快速檢測已知DNA序列的病原微生物·發(fā)展而來DNA芯片技術(shù)用于微生物的偵查檢測，對病原體分類和分型。3、特點分離培養(yǎng)—周期長，操作繁雜，制約因素多

eg:結(jié)核分枝桿菌(1)培養(yǎng)：1～2個月有合適引物，PCR檢測、測序：<1d

(2)檢測敏感度

ZN染色：27．7％培養(yǎng)：19．9％電鏡觀察—直觀快速，但昂貴免疫學(xué)診斷—簡便快速，但存在問題：不易檢出潛伏期的病毒有些病毒亞型多，抗原變異性大整合進入人基因組的病毒

eg：麻風(fēng)病組織活檢抗酸染色鏡檢：陽性率低

傳統(tǒng)病原學(xué)檢驗法3、特點病原學(xué)基因診斷的優(yōu)勢：1.快速檢測出病原體-確定感染源2.快速分型-明確病原體致病性或者藥物敏感性3.可鑒定需要復(fù)雜培養(yǎng)條件或不能體外培養(yǎng)的病原微生物3、特點最成功的例子：小亞基(16S)rRNA基因測序為基礎(chǔ)的微生鑒定系統(tǒng)

16SrRNA基因序列資料庫

通過對美國菌株培養(yǎng)收集中心(AmericanTypeCultureCollectionATCC）超過1200種原生型菌種的比較，選擇了核苷數(shù)量適合研究分析的16SrRNA作為比較基因序列的基礎(chǔ)，建立該資料庫。此系統(tǒng)包括以下步驟:核酸提取—PCR基因擴增—序列測定—計算機輔助分析4、應(yīng)用1-用16SrRNA序列同源性鑒定細菌：同屬細菌：>=９５％同種細菌：>=９９％【Jclin

Miicrobiol，2003.41（9】2-對PCR產(chǎn)物進行限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）建立了14種臨床常見病原菌菌株特有的酶切圖譜

［Ｊ］．中華實用診斷與治療雜志，2009,23(12)3-對擴增產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳分析，直接觀察其多樣性Goldenberg等人還在此基礎(chǔ)上建立了DHPLC技術(shù)【JDis，2008，9（4）：190－18;．Microbiology，1996，142（Pt1）：3－1】5、發(fā)展封閉式、自動化、定量化又分為蛋白芯片、基因芯片及其他類高通量微型化自動化用于微生物的偵查檢測，分類和分型生物芯片OO

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OOOOOOOOOOOOOOHIV基因芯片檢測傳統(tǒng)方法：免疫法-血清HIV抗體初篩、Western印跡法確證-可能存在的非特異性假陽性反應(yīng)，常需進行2次、甚至3次血清學(xué)測定

原因：病毒多亞型，抗體結(jié)合有交叉免疫-對某些病原體而言,基因診斷的特異性問題尚未完全解決;-細菌對藥物的敏感度測試問題目前還不能完全用基因診斷法來解決;-某種病原體的毒性,如病毒的細胞毒性測定也不能用基因診斷法完成;-病原體的形態(tài)學(xué)研究更是不能為基因診斷取代-不能得知病原體進入體內(nèi)后機體的反應(yīng)6、局限小組成員及分工（根據(jù)拼音首字母順序）閱讀文獻、提出問題、制定學(xué)習(xí)計劃：

彭文貝、張俊查閱資料、解決問題：

蘭佳佳、汪珉杰、張寒珂制作展示幻燈：

樂可浩、朱佳異演講展示學(xué)習(xí)成果：

唐露主要參考文獻：

【1】臨床病原微生物快速診斷技術(shù)進展呂游1綜述．王輝2姜可偉1，王杉”、審校國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志2013年4月第34卷第7期

【2】16SrRNA基因及16S~23SrRNA基因間區(qū)在微生物鑒定中的應(yīng)用王艷萍綜述夏云審校國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志2013年4月第34卷第8期

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