cd4+cd25+foxp3+調(diào)節(jié)細胞的生物學(xué)特性

cd4+cd25+foxp3+調(diào)節(jié)細胞的生物學(xué)特性

treg細胞在細胞免疫中的作用由于t反應(yīng)性細胞（treg）的存在，抑制了自身反應(yīng)性細胞的傳播，維護了身體環(huán)境的穩(wěn)定，預(yù)防和防止了自身免疫病的發(fā)生和發(fā)展，減少了身體過度免疫反應(yīng)引起的組織損傷。因此，近年來以treg細胞為基礎(chǔ)的細胞治療自身免疫病和過度反應(yīng)性炎癥引起了人們的興趣。體內(nèi)具有免疫調(diào)節(jié)的細胞主要包括：Th3、Tr1、CD8+CD28-細胞、NK2和Treg細胞等。表達FOXP3的專職調(diào)節(jié)T細胞是維持機體免疫平衡最重要的細胞。Treg細胞根據(jù)其產(chǎn)生部位以及生物學(xué)特性上的差異可分為2個亞群，分別稱為天然調(diào)節(jié)T細胞（naturallyoccurringTregs,nTreg）和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細胞（inducibleTregs,iTreg）。nTreg在胸腺中自然發(fā)育成熟，iTreg在外周淋巴組織中或體外IL-2和TGF-β條件下，由傳統(tǒng)的CD4+FOXP3-細胞轉(zhuǎn)化為而來。1cd2和tgf-trag細胞是受誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)細胞nTreg細胞的生長發(fā)育受胸腺微環(huán)境的嚴格控制。Jordan等用自身抗原肽在胸腺中誘生出自身反應(yīng)性nTreg，并且發(fā)現(xiàn)，自身反應(yīng)性抗原肽-MHC-II復(fù)合物與TCR必須有較高的親和力才能成功誘生，低親和力抗原不能通過這樣的路徑激發(fā)nTreg細胞產(chǎn)生和發(fā)育。這一過程也需要樹突狀細胞提供很強的CD28共刺激信號，因為在CD28缺陷鼠中nTreg細胞顯著減少。自身反應(yīng)性抗原肽并不是在T細胞發(fā)育過程中誘導(dǎo)nTreg細胞產(chǎn)生，是通過淋巴細胞陽性選擇和陰性選擇而生成的一種特定的細胞品系，nTreg在胸腺中發(fā)育成熟，適應(yīng)胸腺細胞表達的自身抗原，所以，nTreg細胞本身就是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞，在其成熟遷移至外周循環(huán)過程中，其表達FOXP3的生物學(xué)特性不受所處微環(huán)境的影響。iTreg細胞是成熟的na觙veCD4細胞在外周免疫器官中受微環(huán)境的影響，而逐漸表達CD25和FOXP3，因此，它是一種誘導(dǎo)型的、具有免疫調(diào)節(jié)的細胞。na觙veCD4細胞轉(zhuǎn)化為iTreg細胞，主要依賴外周淋巴器官中樹突狀細胞和所在的微環(huán)境。研究證實：用微量的抗原適度活化樹突狀細胞能夠誘導(dǎo)na觙veCD4細胞表達FOXP3，成為有免疫抑制作用的iTreg，添加TGF-β細胞增殖受到一定的抑制，但是轉(zhuǎn)化為表達FOXP3細胞的比率大幅上升，這些細胞與機體對外部抗原免疫耐受、腫瘤細胞的免疫逃避及過度的免疫應(yīng)答密切相關(guān)。體內(nèi)iTreg的誘導(dǎo)，不需要很強的TCR刺激，而是需要適度的抗原刺激，用B7中和抗體阻斷CD28的作用，提高共刺激分子CTLA-4和I-COS的作用，均有利于iTreg的發(fā)育。給DO11.10SCID鼠口服OVA抗原，5天以后在其腸系膜淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)大量的iTreg，對照組服用BAS，沒有見到iTreg增加的現(xiàn)象,說明適度的抗原刺激能夠誘導(dǎo)iTreg的產(chǎn)生，這些iTreg細胞可以在腸道固有層中持續(xù)分化，以適應(yīng)微生物和食物對腸道的刺激，避免腸道對它們的免疫應(yīng)答。也有研究發(fā)現(xiàn)，用低劑量的CD28抗體（JJ316）能誘導(dǎo)體內(nèi)Treg大量產(chǎn)生，而且并不伴隨全身性淋巴細胞增生，提示Treg細胞對CD28抗體的刺激比較敏感。TGF-β在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)CD4+CD25-細胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+細胞是必須的，但在nTreg的發(fā)育中卻存在爭議。采用敲除T細胞TGF-β受體方式的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β不涉及胸腺中nTreg的發(fā)育。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TGF-β1受體缺陷小鼠能出現(xiàn)嚴重的nTreg增生缺陷，因此認為TGF-β與nTreg的發(fā)育相關(guān)。IL-2對iTreg細胞發(fā)育是必須的。Na觙veCD4細胞用anti-CD3和TGF-β刺激得到iTreg細胞，高濃度的IL-2能夠緩解TGF-b介導(dǎo)的細胞增殖抑制。用IL-2抗體和IL-2缺陷鼠T細胞證實，體外誘導(dǎo)FOXP3表達及其抑制活性的發(fā)揮，IL-2是必不可少的。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HIV患者經(jīng)抗病毒和IL-2治療后，通常會有CD4細胞的初步恢復(fù)，但是其免疫缺陷的狀態(tài)并沒有相應(yīng)的恢復(fù)。在對長期接受IL-2治療的HIV患者CD4細胞分析中發(fā)現(xiàn)，主要存在2個不同的細胞亞群，分別是CD4+CD25loCD127loFOXP3+和CD4+CD25hiCD127loFOXP3hi，其基因表達也類似健康人的Treg，這應(yīng)引起人們的注意，長期使用IL-2可能導(dǎo)致Treg細胞增生，從而抑制機體的免疫狀態(tài)。目前，人們對體內(nèi)誘導(dǎo)iTreg所必需的微環(huán)境知之甚少，但已經(jīng)認識到無論體內(nèi)還是體外，iTreg發(fā)育至少需要TCR刺激、IL-2和TGF-β的參與。2ntreg細胞的誘導(dǎo)表達通常外周血中Treg細胞數(shù)量很少，一般為CD4細胞的5-10%。為了達到治療所需的細胞數(shù)，必須體外擴增足量的nTreg和/或iTreg細胞，尤其是因iTreg更容易獲得，且在免疫抑制功能上與nTreg接近，是目前研究的熱點。nTreg的分離通常有磁珠分離法和流式細胞儀分離法。體外擴增nTreg首先需要得到高純度的nTreg細胞，實驗研究中多用流式細胞術(shù)分選出CD4+CD25+++的細胞，其細胞純度可達到97-99%。因為nTreg沒有單一的標識性的免疫標志，磁珠法分離nTreg多采用多次分選法，通常先陰性選擇出CD4細胞，然后再選擇出CD25+細胞，該方法尚無法區(qū)分CD25+和CD25+++細胞群。目前，CD4+CD25+CD127dim/-的細胞也公認為Treg的表面標志，其中約90%的細胞表達FOXP3，因而陰性選擇出CD4+CD127dim/-細胞，再選擇出CD25+細胞也可認為是nTreg細胞。通常認為，在沒有受到抗原刺激的動物體內(nèi)，即便是外周血中CD4+CD25+FOXP3+的調(diào)節(jié)T細胞也可認為屬于nTreg細胞。nTreg細胞體外擴增比較簡單，可直接用1ng/mlPMA,200ng/ml離子霉素活化細胞，在100IU/ml重組IL-2的條件下，就可以使nTreg細胞得到有效的增殖。也有學(xué)者在高濃度的IL-2(2000IU/ml)的情況下，用anti-CD3/anti-CD28微球刺激人外周血分離的CD4+CD25+細胞，使得nTreg細胞擴增200倍，這些細胞體外能夠抑制效應(yīng)T細胞增殖，并且表達nTreg的表型，如：CD62L、HLA-DR、CCR6和FOXP3。Hoffmann等用anti-CD3和anti-CD28抗體刺激細胞，在IL-2及CD32+L細胞共存的情況下，使人外周來源的CD4+CD25+細胞擴增高達1萬倍。從CD4+CD25-的細胞誘導(dǎo)iTreg細胞，則需要用anti-CD3/anti-CD28微球活化細胞，在10ng/mlTGF-β和100I-U/ml重組IL-2的條件下，可以得到增殖。盡管體內(nèi)也可以誘導(dǎo)出iTreg，但是目前還沒有有效的鑒定方法。體外誘導(dǎo)iTreg的優(yōu)勢是可誘導(dǎo)具有抗原特異性的iTreg細胞，回輸體內(nèi)后，能夠以抗原特異性的方式抑制相應(yīng)的免疫應(yīng)答。體外用TGF-β和IL-2結(jié)合TCR的刺激，能誘導(dǎo)CD4+CD25-細胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+細胞，高表達FOXP3。Selvaraj等較為詳細的研究了在誘導(dǎo)過程中細胞動力學(xué)的變化，用CD3/CD28刺激CD4+FOXP3-細胞，加入TGF-β后2-3天，F(xiàn)OXP3就開始明顯上調(diào)，90%以上的細胞發(fā)生了轉(zhuǎn)化。他們發(fā)現(xiàn)FOXP3表達需要嚴格的TCR刺激，但是不需要共刺激分子的作用，也不依賴細胞周期的改變。除去TGF-β4天后FOXP3大多丟失。大部分移植進入鼠體內(nèi)的iTreg細胞，2天內(nèi)后FOXP3的表達開始下調(diào)。這些FOXP3-的細胞主要分布在血液、脾、肺和肝內(nèi)。移植iTreg28天后，只能檢出很少的FOXP3-細胞，但是FOXP3+細胞依然能被檢出，他們主要定位于淋巴結(jié)和骨髓。所以，體外誘導(dǎo)的iTreg輸入體內(nèi)后，F(xiàn)OXP3表達是短暫的，并且是TGF-β依賴性的。在體內(nèi)輸入的iTreg中有一個亞群會長期存在于體內(nèi)，提供一個長久調(diào)節(jié)免疫活性的功能。3tsdr甲基化nTreg和iTreg均表達CD4+CD25+FOXP3+，目前還沒有公認的區(qū)分兩者的方法。一般認為，在沒有受到抗原刺激的情況下，CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞大多屬于nTreg，如果受到抗原刺激，則在機體內(nèi)nTreg和iTreg共存。nTreg表達CTLA-4(細胞毒T淋巴細胞抗原4)、GITR(糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體),CCR4(趨化因子受體)和CD62L,絕大多數(shù)nTreg都是已經(jīng)活化的CD4+T細胞(例如：鼠CD45RBlow，人表達CD45RO)。iTreg需要另外的、適度的抗原刺激，才能從na觙veCD4+CD25-細胞轉(zhuǎn)化而來，表達記憶細胞的某些標志。體內(nèi)直接分選的nTreg，其FOXP3基因外顯子1上游進化保守區(qū)(Tregcell-specificdemethylatedregion,TSDR)全部去甲基化，而體外誘導(dǎo)的iTreg盡管高表達FOXP3，但是其TSDR僅部分去甲基化，而CD4+CD25-T細胞TSDR全部甲基化。TSDR甲基化能抑制FOXP3表達，干擾Treg細胞的發(fā)育和免疫抑制功能作用的發(fā)揮，TSDR去甲基化是細胞穩(wěn)定表達FOXP3所必要的。所以，當沒有TGF-β存在時，再次刺激iTreg，會喪失FOXP3的表達，而nTreg則無此現(xiàn)象。體外和體內(nèi)擴增的iTregTSDR甲基化狀態(tài)也有顯著的差異，nTreg和體內(nèi)誘導(dǎo)的iTreg一樣，都能保持有效的TSDR未甲基化狀態(tài)，這與體外誘導(dǎo)的iTreg不一樣。Polansky報告了氮胞苷（azacytidine）對DNA甲基化的抑制作用，體內(nèi)用DEC-205誘導(dǎo)的iTreg可長期存在表達FOXP3，顯示出有效的TSDR去甲基化狀態(tài)，可以保持3周。體外誘導(dǎo)的iTreg,STDR去甲基化狀態(tài)僅僅保持6天。FOXP3基因TSDR區(qū)的甲基化與否，控制了nTreg和iTreg表達FOXP3的狀態(tài)，TSDR甲基化使其表達FOXP3功能喪失，反之則高表達。nTreg和iTreg，特別是體外誘導(dǎo)的iTreg其TSDR甲基化狀態(tài)各不相同，從而表現(xiàn)出不同的特性。4rag-缺陷鼠的誘導(dǎo)使用相關(guān)細胞nTreg和iTreg都能夠保持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，預(yù)防自身免疫病的發(fā)生，阻止自身免疫病的發(fā)展的作用是公認的。TGF-β1和TGF-β受體基因敲除鼠發(fā)生嚴重的自身免疫病，盡管此時在胸腺中nTreg發(fā)育正常，但其在外周的免疫抑制功能受到很大地限制。由于TGF-β缺陷CD4+CD25-T細胞不能轉(zhuǎn)化為iTreg，因此，iTreg和nTreg在抑制免疫應(yīng)答中的相互作用開始引起人們的注意。Haribhai等用結(jié)腸炎模型比較了nTreg、體外誘導(dǎo)的iTreg體內(nèi)誘導(dǎo)的iTreg的功能。轉(zhuǎn)移CD4+FOPX3-細胞進入RAG-缺陷鼠誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型。如果na觙veT細胞因FOPX3基因突變而不能轉(zhuǎn)變?yōu)閕Treg，則疾病進展很快。當移植具有正常FOXP3基因鼠效應(yīng)T細胞之后，nTreg比體外誘導(dǎo)的iTreg能更好的控制疾病的發(fā)展。但是，重要的是：在FOXP3缺陷鼠中，必須iTreg和nTreg聯(lián)合應(yīng)用，才能對結(jié)腸炎模型鼠有保護作用（移植FOXP3缺陷鼠CD4細胞誘導(dǎo)的模型）。如果效應(yīng)細胞來自于FOXP3基因正常的鼠，則只用nTreg就能抑制疾病的進程，主要是在鼠體內(nèi)，部分效應(yīng)細胞可轉(zhuǎn)變?yōu)閕Treg細胞。由此，在結(jié)腸炎模型中，如果要阻止疾病的進展，nTreg和iTreg（體外誘導(dǎo)的或者體內(nèi)誘導(dǎo)的）兩種細胞都是必須的。在通常的實驗研究中nTreg細胞實際上主要是nTreg，同時也包含了一部分體內(nèi)誘導(dǎo)的iTreg。只有nTreg與iTreg共存時（無論是體內(nèi)誘導(dǎo)還是體外誘導(dǎo)的iTreg），結(jié)腸炎模型鼠病情得到有效的控制，加之iTreg與nTreg基因表達圖譜顯著不同，提示iTreg與nTreg是兩類不同的細胞，兩者是相互協(xié)同來維持機體的免疫耐受。5外周血il-17+生物免疫細胞Treg細胞作為具有免疫抑制能力的細胞，盡管在動物模型上顯示了良好的阻止自身免疫病、哮喘等疾病發(fā)生發(fā)展的作用。但是大多動物實驗效果都是短期觀察，相對于人類慢性自身免疫病、哮喘和器官移植還有許多問題沒有得到解決，如：nTreg在體內(nèi)有轉(zhuǎn)變?yōu)榉置贗L-17的可能，加重疾病