人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則

人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則

一、引言

由于分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)及重組DNA（rDNA）技術(shù)的快速發(fā)展，現(xiàn)已能夠擬定和獲得許多天然活性蛋白的編碼基因，將其插入體現(xiàn)載體或引入某種宿主細(xì)胞后，能有效地體現(xiàn)該基因產(chǎn)物，再經(jīng)分離、純化和檢定，可得到用于防止和治療某些人類疾病的制品，諸如現(xiàn)有的乙型肝炎疫苗、胰島素、生長(zhǎng)激素、干擾素等。

用不同于常規(guī)辦法的rDNA技術(shù)生產(chǎn)的制品，是近年來(lái)出現(xiàn)的新產(chǎn)品，評(píng)價(jià)其安全性和有效性亦不同于常規(guī)辦法。這一領(lǐng)域中的知識(shí)和技術(shù)還在不停發(fā)展，為了有助于這類制品在我國(guó)的研究和發(fā)展，并為這類制品的審評(píng)提供根據(jù)，有必要制訂一種原則性指導(dǎo)文獻(xiàn)，以確保在人群中實(shí)驗(yàn)或應(yīng)用時(shí)安全有效。

本“人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則”（下列簡(jiǎn)稱《指導(dǎo)原則》）不可能面面俱到，可能有許多專門技術(shù)問(wèn)題會(huì)出現(xiàn)，對(duì)于這類問(wèn)題或某一特定制品，則應(yīng)視具體問(wèn)題具體研究決定。本《指導(dǎo)原則》亦將隨科學(xué)技術(shù)發(fā)展和經(jīng)驗(yàn)積累而逐步完善。

二、總則

（一）本《指導(dǎo)原則》合用于rDNA技術(shù)生產(chǎn)并在人體內(nèi)應(yīng)用的蛋白質(zhì)、肽類制品。

（二）凡屬與普通生物制品有關(guān)的質(zhì)量控制，均按現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。有關(guān)生產(chǎn)設(shè)施的規(guī)定應(yīng)參考國(guó)家藥品監(jiān)督管理局《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》執(zhí)行。

三、質(zhì)量控制規(guī)定

（一）原材料的控制

1．體現(xiàn)載體和宿主細(xì)胞

應(yīng)提供有關(guān)體現(xiàn)載體具體資料，涉及基因的來(lái)源、克隆和鑒定，體現(xiàn)載體的構(gòu)建、構(gòu)造和遺傳特性。應(yīng)闡明載體構(gòu)成各部分的來(lái)源和功效，如復(fù)制子和啟動(dòng)子來(lái)源，或抗生素抗性標(biāo)志物。提供最少涉及構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜。應(yīng)提供宿主細(xì)胞的資料，涉及細(xì)胞株（系）名稱、來(lái)源、傳代歷史、檢定成果及基本生物學(xué)特性等。

應(yīng)具體闡明載體引入宿主細(xì)胞的辦法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)（與否整合到染色體內(nèi)）及拷貝數(shù)。應(yīng)提供宿主和載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性資料。

2．克隆基因的序列

應(yīng)提供插入基因和體現(xiàn)載體兩側(cè)端控制區(qū)的核苷酸序列。全部與體現(xiàn)有關(guān)的序列均應(yīng)具體敘述。

3．體現(xiàn)

應(yīng)具體敘述在生產(chǎn)過(guò)程中，啟動(dòng)和控制克隆基因在宿主細(xì)胞中的體現(xiàn)所采用的辦法及體現(xiàn)水平。4．原輔料

原輔料應(yīng)按照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。動(dòng)物源性原料的使用應(yīng)提供來(lái)源及質(zhì)控檢測(cè)資料；發(fā)酵用培養(yǎng)基不能添加β內(nèi)酰胺類抗生素。（二）生產(chǎn)的控制

1．主細(xì)胞庫(kù)（MASTERCELLBANK）

rDNA制品的生產(chǎn)應(yīng)采用種子批（SEEDLOT）系統(tǒng)。從已建立的主細(xì)胞庫(kù)中，再進(jìn)一步建立生產(chǎn)細(xì)胞庫(kù)（WCB）。

含體現(xiàn)載體的宿主細(xì)胞應(yīng)通過(guò)克隆而建立主細(xì)胞庫(kù)。在此過(guò)程中，在同一實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)內(nèi)，不得同時(shí)操作兩種不同細(xì)胞（菌種）；一種工作人員亦不得同時(shí)操作兩種不同細(xì)胞或菌種。

應(yīng)具體記述種子材料的來(lái)源、方式、保存及預(yù)計(jì)使用壽命。應(yīng)提供在保存和復(fù)蘇條件下宿主載體體現(xiàn)系統(tǒng)的穩(wěn)定性證據(jù)。采用新的種子批時(shí)，應(yīng)重新作全方面檢定。

真核細(xì)胞用于生產(chǎn)時(shí)，細(xì)胞的鑒別標(biāo)志，如特異性同功酶或免疫學(xué)或遺傳學(xué)特性，對(duì)鑒別所建立的種子是有用的。有關(guān)所用傳代細(xì)胞的致癌性應(yīng)有具體報(bào)告。如采用微生物培養(yǎng)物為種子，則應(yīng)敘述其特異表型特性。

普通狀況下，在原始種子階段應(yīng)確證克隆基因的DNA序列。但在某些狀況下，例如傳代細(xì)胞基因組中插入多拷貝基因。在此階段不適合對(duì)克隆基因作DNA序列分析。在此狀況下，可采用總細(xì)胞DNA的雜交印染分析，或作mRNA的序列分析。對(duì)最后產(chǎn)品的特性鑒定應(yīng)特別注意。

種子批不應(yīng)含有外源致癌因子，不應(yīng)含有感染性外源因子，如細(xì)菌、支原體、真菌及病毒。

有些細(xì)胞株含有某些內(nèi)源病毒，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒，且不易除去。但當(dāng)已確知在原始細(xì)胞庫(kù)或載體部分中污染這類特定內(nèi)源因子時(shí)，則應(yīng)能證明在生產(chǎn)純化過(guò)程可使之滅活或去除。

2．有限代次生產(chǎn)

用于培養(yǎng)和誘導(dǎo)基因產(chǎn)物的材料和辦法應(yīng)有具體資料。對(duì)培養(yǎng)過(guò)程及收獲時(shí)，應(yīng)有敏感的檢測(cè)方法控制微生物污染。

應(yīng)提供培養(yǎng)生長(zhǎng)濃度和產(chǎn)量恒定性方面的數(shù)據(jù)，并應(yīng)確立廢棄一批培養(yǎng)物的指標(biāo)。根據(jù)宿主細(xì)胞／載體系統(tǒng)的穩(wěn)定性資料，擬定在生產(chǎn)過(guò)程中允許的最高細(xì)胞倍增數(shù)或傳代代次，并應(yīng)提供最適培養(yǎng)條件的具體資料。

在生產(chǎn)周期結(jié)束時(shí)，應(yīng)監(jiān)測(cè)宿主細(xì)胞／載體系統(tǒng)的特性，例如質(zhì)?？截悢?shù)、宿主細(xì)胞中體現(xiàn)載體存留程度、含插入基因的載體的酶切圖譜。普通狀況下，用來(lái)自一種原始細(xì)胞庫(kù)的全量培養(yǎng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)，必要時(shí)應(yīng)做一次目的基因的核苷酸序列分析。

3．持續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)

基本規(guī)定同2項(xiàng)。

應(yīng)提供經(jīng)長(zhǎng)久培養(yǎng)后所體現(xiàn)基因的分子完整性資料，以及宿主細(xì)胞的表型和基因型特性。每批培養(yǎng)的產(chǎn)量變化應(yīng)在規(guī)定范疇內(nèi)。對(duì)能夠進(jìn)行后解決及應(yīng)廢棄的培養(yǎng)物，應(yīng)擬定指標(biāo)。從培養(yǎng)開始至收獲，應(yīng)有敏感的檢查微生物污染的方法。

根據(jù)宿主／載體穩(wěn)定性及體現(xiàn)產(chǎn)物的恒定性資料，應(yīng)規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間。如屬長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)培養(yǎng)，應(yīng)根據(jù)宿主／載體穩(wěn)定性及產(chǎn)物特性的資料，在不同間隔時(shí)間作全方面檢定。

4．純化

對(duì)于收獲、分離和純化的辦法應(yīng)具體記述，應(yīng)特別注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物質(zhì)的去除。

如采用親和層析技術(shù)，例如用單克隆抗體，應(yīng)有檢測(cè)可能污染這類外源性物質(zhì)的辦法，不應(yīng)含有可測(cè)出的異種免疫球蛋白。

對(duì)整個(gè)純化工藝應(yīng)進(jìn)行全方面研究，涉及能夠去除宿主細(xì)胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它雜質(zhì)以及在純化過(guò)程中加入的有害的化學(xué)物質(zhì)等。

有關(guān)純度的規(guī)定可視制品的用途和使用方法而擬定，例如，僅使用一次或需重復(fù)多次使用；用于健康人群或用于重癥患者；對(duì)純度可有不同程度規(guī)定。

（三）最后產(chǎn)品的控制

應(yīng)建立有關(guān)產(chǎn)品的鑒別、純度、穩(wěn)定性和活性等方面的實(shí)驗(yàn)辦法。檢測(cè)的必要性和純度規(guī)定取決于多個(gè)因素：產(chǎn)品性質(zhì)和用途、生產(chǎn)和純化工藝及生產(chǎn)工藝的經(jīng)驗(yàn)。普通說(shuō)來(lái)下列實(shí)驗(yàn)對(duì)控制產(chǎn)品質(zhì)量是能夠采用的。新的分析技術(shù)及對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的改善正在不停進(jìn)行，適宜時(shí)應(yīng)使用這些新的技術(shù)。

1．物理化學(xué)鑒定

（1）氨基酸構(gòu)成

使用多個(gè)水解法和分析手段測(cè)定氨基酸的構(gòu)成，并與目的蛋白基因序列推導(dǎo)的氨基酸構(gòu)成或天然異構(gòu)體比較。如需要時(shí)應(yīng)考慮分子量的大小。多數(shù)狀況下，氨基酸構(gòu)成分析對(duì)肽段和小蛋白可提供有價(jià)值的構(gòu)造資料，但對(duì)大蛋白普通意義較小。在多數(shù)狀況下，氨基酸定量分析數(shù)據(jù)可用于擬定蛋白含量。

（2）氨基酸末端序列

氨基酸末端分析用于鑒別N-端和C-端氨基酸的性質(zhì)和同質(zhì)性。若發(fā)現(xiàn)目的產(chǎn)品的末端氨基酸發(fā)生變化時(shí)，應(yīng)使用適宜的分析手段鑒定變異體的對(duì)應(yīng)變異數(shù)量。應(yīng)將這些氨基酸末端序列與來(lái)自目的產(chǎn)品基因序列推導(dǎo)的氨基酸末端序列進(jìn)行比較。

（3）肽譜

應(yīng)用適宜的酶或化學(xué)試劑使所選的產(chǎn)品片段產(chǎn)生不持續(xù)多肽，應(yīng)用HPLC或其它適宜的辦法分析該多肽片段。應(yīng)盡量應(yīng)用氨基酸構(gòu)成分析技術(shù)，N-末端測(cè)序或質(zhì)譜法鑒別多肽片段。對(duì)批簽發(fā)來(lái)說(shuō),經(jīng)驗(yàn)證的肽譜分析經(jīng)常是確證目的產(chǎn)品構(gòu)造/鑒別的適宜辦法。

（4）巰基和二硫鍵

如果根據(jù)目的產(chǎn)品基因序列存在半胱氨酸殘基時(shí)，應(yīng)盡量擬定巰基和/或二硫鍵的數(shù)量和位置。使用辦法涉及肽譜分析（還原和非還原條件下）、質(zhì)譜測(cè)定法或其它適宜的辦法。

（5）碳水化合物構(gòu)造

應(yīng)測(cè)定糖蛋白中碳水化合物含量（中性糖、氨基糖、唾液酸）。另外盡量分析碳水化合物的構(gòu)造、寡糖形態(tài)（長(zhǎng)鏈狀）和多肽的糖基化位點(diǎn)。

（6）分子量

應(yīng)用分子篩層析法、SDS（還原和/或非還原條件下）、質(zhì)譜測(cè)定法、和/或其它適宜技術(shù)測(cè)定分子量。

（7）等電點(diǎn)

通過(guò)等電聚焦電泳或其它適宜的辦法測(cè)定。

（8）消光系數(shù)（或克分子吸光度）

多數(shù)狀況下，可取目的產(chǎn)品于UV/可見光波優(yōu)點(diǎn)測(cè)定消光系數(shù)（或克分子吸光度）。消光系數(shù)的測(cè)定為使用UV/可見光或分光光度計(jì)檢測(cè)已知蛋白含量的溶液，蛋白含量應(yīng)用氨基酸構(gòu)成分析技術(shù)或定氮法等辦法測(cè)定。

（9）電泳圖型

應(yīng)用PAGE電泳、等電聚焦、SDS－PAGE電泳、免疫印跡、毛細(xì)管電泳法或其它適宜的辦法,獲得目的產(chǎn)品/藥品的一致性,同一性和純度的電泳圖譜和數(shù)據(jù)。

（10）液相層析圖譜

應(yīng)用分子篩層析、反相液相層析、離子交換液相層析、親和層析或其它適宜辦法，獲得目的產(chǎn)品/藥品的一致性、同一性和純度的層析圖譜和數(shù)據(jù)。

（11）光譜分析

適宜時(shí)，應(yīng)用紫外或可見光吸取光譜法測(cè)定，使用圓二色譜、核磁共振（NMR）、或其它適宜的辦法檢測(cè)制品的高級(jí)構(gòu)造。

2．雜質(zhì)檢測(cè)

（1）工藝有關(guān)雜質(zhì)

工藝有關(guān)雜質(zhì)來(lái)源于生產(chǎn)工藝，可分三大類：來(lái)源于細(xì)胞基質(zhì)、培養(yǎng)基和下游工藝。

①來(lái)源于細(xì)胞基質(zhì)的雜質(zhì)涉及源于宿主生物體的蛋白/多肽；核酸（宿主細(xì)胞/載體/總DNA）；多糖及病毒。對(duì)于宿主細(xì)胞蛋白，普通應(yīng)用能檢測(cè)出較寬范疇蛋白雜質(zhì)的敏捷的免疫檢測(cè)辦法。應(yīng)用不含目的基因的生物體粗提物，即不含產(chǎn)品編碼基因的生產(chǎn)用細(xì)胞，制備上述實(shí)驗(yàn)使用的多克隆抗體?？赏ㄟ^(guò)對(duì)產(chǎn)品的直接分析辦法（如雜交技術(shù)法）檢測(cè)宿主細(xì)胞的DNA水平，和/或通過(guò)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)室規(guī)模）檢測(cè)證明通過(guò)純化工藝能去除核酸。對(duì)于故意導(dǎo)入的病毒，應(yīng)驗(yàn)證生產(chǎn)工藝中去除/滅活病毒的能力。

②來(lái)源于培養(yǎng)基的雜質(zhì)涉及誘導(dǎo)劑（多核苷酸,病毒）、抗生素、血清及其它培養(yǎng)基組分。

③來(lái)源于下游工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)涉及酶、化學(xué)/生化解決試劑（如溴化氰、胍、氧化劑和還原劑）、無(wú)機(jī)鹽（如重金屬、砷、非有色金屬離子）、溶劑、載體/配體（如單克隆抗體），及其它可濾過(guò)的物質(zhì)。

（2）產(chǎn)品有關(guān)雜質(zhì)

下列為最常見的目的產(chǎn)品的分子變異體，并列出了對(duì)應(yīng)的檢測(cè)辦法：

①化學(xué)修飾類型：應(yīng)考慮脫酰胺、異構(gòu)化、錯(cuò)配S-S連接和氧化形式的分離和鑒別。對(duì)這些變異體的分離和鑒別，可應(yīng)用層析法和/或電泳法（如HPLC、毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜法、圓二色譜）。

②降解物和聚合體：聚合體涉及二聚體和多聚體：可用分子篩層析法（如SE-HPLC）進(jìn)行定量；降解物：應(yīng)建立降解物的鑒定原則，并對(duì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的降解產(chǎn)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

3．生物學(xué)測(cè)定

（1）鑒別實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用免疫印跡法，或者在可能狀況下，應(yīng)用參考品將rDNA制品與天然產(chǎn)品通過(guò)生物學(xué)比較實(shí)驗(yàn)，擬定其與天然產(chǎn)品是一致的。

（2）效價(jià)測(cè)定

采用國(guó)際或國(guó)家參考品，或通過(guò)國(guó)家檢定機(jī)構(gòu)承認(rèn)的參考品，以體內(nèi)或體外法測(cè)定制品的生物學(xué)活性，并標(biāo)明其活性單位。

（3）特異比活性測(cè)定

在測(cè)定生物學(xué)活性的基礎(chǔ)上，對(duì)有些制品還應(yīng)用適宜辦法測(cè)定主藥蛋白含量，測(cè)定其特異比活性，以活性單位／重量表達(dá)。

（4）熱原質(zhì)實(shí)驗(yàn)

應(yīng)采用家兔法或鱟實(shí)驗(yàn)法（LAL）作熱原質(zhì)檢測(cè)，控制原則可參考天然制品的規(guī)定。

（5）無(wú)菌實(shí)驗(yàn)

參考現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》有關(guān)規(guī)定進(jìn)行，應(yīng)證明最后制品無(wú)細(xì)菌污染。

（6）抗原性物質(zhì)檢查

必要時(shí)，如制品屬大劑量重復(fù)使用者，應(yīng)測(cè)定最后制品中可能存在的抗原性物質(zhì)，如宿主細(xì)胞、亞細(xì)胞組分及培養(yǎng)基成分等。患者重復(fù)接受大劑量的這類制品時(shí)，應(yīng)親密監(jiān)測(cè)由這些抗原可能產(chǎn)生的抗體或變態(tài)反映。

（7）異常毒性實(shí)驗(yàn)

可參考現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

4．其它

根據(jù)產(chǎn)品劑型，應(yīng)有外觀（如固體、液體、色澤、澄明度等方面的描述）、水分、PH值、裝量等方面的規(guī)定，可參考現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

四、臨床前安全性評(píng)價(jià)

臨床前安全性實(shí)驗(yàn)的目的重要是擬定新制品與否會(huì)在人體引發(fā)未能預(yù)料的不良反映。但是，用于普通化學(xué)藥品的傳統(tǒng)安全性或毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)rDNA產(chǎn)品不一定合用，用傳統(tǒng)毒性實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)rDNA產(chǎn)品往往有困難，并受多個(gè)因素的影響。例如，某些蛋白質(zhì)，如干擾素，含有高度種屬特異性，這種人的蛋白質(zhì)對(duì)人的藥理學(xué)活性遠(yuǎn)高于對(duì)動(dòng)物的活性，并且人的蛋白質(zhì)氨基酸序列，經(jīng)常與來(lái)自其它種系的蛋白質(zhì)不同，例如糖基就不同。因而由基因工程技術(shù)所制備的蛋白質(zhì)或肽類往往會(huì)在人體以外的其它宿主中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其生物學(xué)效應(yīng)有所變化，并可能因形成免疫復(fù)合物而造成有毒性反映，而這樣產(chǎn)生的毒性反映與人體