Cell Metabolism（IF=29）：川大揭示骨骼肌細(xì)胞外囊泡運(yùn)輸糖酵解酶介導(dǎo)肌肉與骨的串?dāng)_

CellMetabolism（IF=29）：四川大學(xué)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡在肌肉與骨串?dāng)_中的重要作用小高探究骨骼肌如何控制骨形成對(duì)于理解肌肉和骨骼之間的相互作用以及開(kāi)發(fā)退行性骨病的治療方法至關(guān)重要。2023年11月7日，四川大學(xué)廖立及田衛(wèi)東共同通訊在CellMetabolism發(fā)表題為“Skeletalmuscle-derivedextracellularvesiclestransportglycolyticenzymestomediatemuscle-tobonecrosstalk”的文章，揭示骨骼肌來(lái)源的細(xì)胞外囊泡（Mu-EVs）運(yùn)輸糖酵解酶介導(dǎo)肌肉與骨的串?dāng)_。Mu-EVs經(jīng)外周血到達(dá)骨骼進(jìn)而被骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）攝取，促進(jìn)其成骨分化，對(duì)小鼠廢用性骨質(zhì)疏松癥具有保護(hù)作用。01：骨骼肌分泌豐富的EV研究首先確定了培養(yǎng)的小鼠后肢肌肉組織上清含有豐富的EV。進(jìn)一步將表達(dá)CD63的AAV載體（MHCK7-CD63-EGFP-AAV）局部注射到小鼠后肢的雙側(cè)骨骼肌中，從這些肌肉中分離出的Mu-EV有58%可被CD63-EGFP標(biāo)記（圖1A），EGFP+EV可以在血清中被檢測(cè)到，且運(yùn)動(dòng)后血清中富集EGFP+EV高于運(yùn)動(dòng)前，這些結(jié)果表明骨骼肌在體內(nèi)分泌的EV可以進(jìn)入外周血中（圖1B）。圖1骨骼肌分泌豐富的EV（Mu-EV）02：Mu-EV進(jìn)入骨骼組織并被BMSC吸收將MHCK7-CD63-EGFP-AAV載體局部注射到小鼠雙側(cè)后肢的骨骼肌中（圖2A），發(fā)現(xiàn)小梁骨、皮質(zhì)骨和生長(zhǎng)板中的骨髓細(xì)胞亞群呈EGFP陽(yáng)性，此外在皮質(zhì)骨的微血管中也檢測(cè)到熒光信號(hào)（圖2B），表明Mu-EV可能通過(guò)血液循環(huán)直接轉(zhuǎn)移到骨骼中。隨后采用DiR標(biāo)記的Mu-EV通過(guò)尾靜脈注射到循環(huán)中，發(fā)現(xiàn)注射后1、6和24h在小鼠骨骼中檢測(cè)到熒光信號(hào)，表明Mu-EV可以轉(zhuǎn)運(yùn)到骨組織中（圖2C）。進(jìn)一步將MHCK7-CD63-EGFP-AAV載體轉(zhuǎn)染的骨骼肌與BMSC進(jìn)行離體共培養(yǎng)，24h后在BMSC內(nèi)觀察到大量EGFP陽(yáng)性顆粒（圖2D）。結(jié)果表明由骨骼肌主動(dòng)分泌的Mu-EV可以運(yùn)輸?shù)焦趋啦⒈籅MSC吸收。圖2Mu-EV進(jìn)入骨骼并被BMSC吸收03：Mu-EV增強(qiáng)BMSCs成骨分化緩解廢用性骨質(zhì)疏松癥采用茜素紅S染色、堿性磷酸酶活性測(cè)定、成骨相關(guān)基因qPCR均證實(shí)Mu-EV促進(jìn)BMSC成骨分化（圖3A）。進(jìn)一步構(gòu)建了2種小鼠模型：1）跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)來(lái)增加肌肉力量；2）局部注射A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素（BoNT/A）誘導(dǎo)肌營(yíng)養(yǎng)不良。發(fā)現(xiàn)兩種小鼠模型后肢分離的Mu-EV形態(tài)或顆粒大小無(wú)差異，Mu-EV顆粒數(shù)量在運(yùn)動(dòng)后增加，在肌營(yíng)養(yǎng)不良后減少。此外，與普通Mu-EV相比，肌營(yíng)養(yǎng)不良組Mu-EV促進(jìn)BMSC成骨效果差（圖3B），而運(yùn)動(dòng)小鼠Mu-EV促進(jìn)BMSC成骨效果更好（圖3C）。表明Mu-EV的分泌和生物活性與骨骼肌功能呈正相關(guān)。此外，通過(guò)尾靜脈將正常的Mu-EV注射到肌肉萎縮小鼠模型，發(fā)現(xiàn)Mu-EV治療改善BoNT/A誘導(dǎo)的廢用性骨質(zhì)疏松癥，運(yùn)動(dòng)小鼠的Mu-EV效果更好（圖3D）。圖3Mu-EV增強(qiáng)BMSCs成骨分化緩解骨質(zhì)疏松癥04：蛋白質(zhì)組學(xué)揭示骨骼肌EV包含糖酵解酶采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測(cè)正常小鼠和肌肉萎縮小鼠中分離出的Mu-EV，對(duì)39種在肌肉萎縮小鼠Mu-EV中的下調(diào)蛋白開(kāi)展GO、KEGG分析，KEGG顯示大約一半蛋白參與代謝通路（圖4A），GO顯示許多蛋白質(zhì)與葡萄糖代謝相關(guān)途徑有關(guān)（圖4B）。進(jìn)一步對(duì)正常小鼠和運(yùn)動(dòng)小鼠中分離出的Mu-EV進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，上調(diào)蛋白的GO、KEGG分析顯示出與上述研究結(jié)果一致（華盈生物為該研究提供了細(xì)胞外囊泡蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)服務(wù)）。結(jié)果表明骨骼肌將糖酵解酶分泌到Mu-EV中以調(diào)節(jié)受體組織/細(xì)胞中糖酵解相關(guān)反應(yīng)。圖4Mu-EV富含糖酵解酶05：體內(nèi)/外實(shí)驗(yàn)揭示骨骼肌EV調(diào)節(jié)糖酵解促進(jìn)成骨分化用魚(yú)藤酮激活糖酵解增強(qiáng)BMSC成骨分化，而用2-DG抑制糖酵解減少成骨分化，Mu-EV和魚(yú)藤酮對(duì)增強(qiáng)BMSC成骨分化具有協(xié)同作用，而抑制糖酵解會(huì)阻斷Mu-EV對(duì)BMSC成骨分化的促進(jìn)作用（圖5A、5B）。2-DG處理完全阻斷了運(yùn)動(dòng)對(duì)骨量的積極作用運(yùn)動(dòng)小鼠的Mu-EV的促成骨活性，此外，Mu-EV對(duì)肌肉萎縮小鼠的治療作用被2-DG通過(guò)抑制糖酵解所抵消。結(jié)果表明Mu-EV在體內(nèi)外主要通過(guò)增強(qiáng)糖酵解來(lái)促進(jìn)骨形成（圖5C、5D）。圖5骨骼肌EV調(diào)節(jié)糖酵解促進(jìn)成骨分化06：Mu-EV通過(guò)運(yùn)輸糖酵解酶LDHA誘導(dǎo)糖酵解前面的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示PKM和LDHA是候選糖酵解酶，在正常Mu-EV中高表達(dá)，肌肉萎縮Mu-EV中表達(dá)減少。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)小鼠Mu-EVs中的LDHA水平顯著增加，而PKM水平保持不變，且Mu-EV治療提高BMSC和骨組織中LDHA水平，而PKM水平保持不變。進(jìn)一步siRNA敲低小鼠骨骼肌細(xì)胞系C2C12中的LDHA和PKM，發(fā)現(xiàn)敲低LDHA后的EV促進(jìn)BMSC成骨能力較差，而敲低PKM無(wú)影響，結(jié)果表明LDHA是Mu-EV中激活BMSC糖酵解的候選蛋白。進(jìn)一步利用AAV（AAV-shRNA-Ldha）在肌肉中特異性降低LDHA（圖6A），發(fā)現(xiàn)接受AAV-sh-Ldha注射的小鼠的Mu-EV在促進(jìn)葡萄糖消耗、乳酸產(chǎn)生以及BMSC中LDHA和成骨基因的表達(dá)方面效率較低（圖6B、6C）。結(jié)果表明Mu-EVs主要通過(guò)運(yùn)輸糖酵解酶LDHA影響骨形成。圖6Mu-EV通過(guò)運(yùn)輸糖酵解酶LDHA誘導(dǎo)糖酵解Mu-EV的作用機(jī)制模式圖如下：圖7研究作用機(jī)制模式圖總結(jié)與討論研究首先發(fā)現(xiàn)Mu-EVs的數(shù)量和生物活性與骨骼肌功能密切相關(guān)，隨后通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示Mu-EVs中有許多蛋白質(zhì)，其中一些可能調(diào)節(jié)骨代謝，特別是糖酵解酶。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)Mu-EVs通過(guò)將LDHA輸送到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，促進(jìn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的糖酵解。研究為治療廢用性骨質(zhì)疏松癥提供了一種有希望的方法。該案例為我們開(kāi)展外泌體蛋白機(jī)制研究提供了很好的參考，不同細(xì)胞之間通過(guò)外泌體進(jìn)行功能分子的傳遞，通過(guò)組學(xué)的方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體中功能分子的檢測(cè)。華盈生物是外泌體研究服務(wù)領(lǐng)域的領(lǐng)導(dǎo)品牌，擁有外泌體研究“一站式服務(wù)”體系，覆蓋外泌體研究的方方面面，包括：外泌體的三項(xiàng)鑒定（電鏡、WB、NTA）、外泌體蛋白組和修飾蛋白組篩選（Label?free、4D-DIA、PRM、MRM）、外泌體核酸篩選（miRNA、全轉(zhuǎn)錄組）、外泌體納米流式檢測(cè)、外泌體細(xì)胞&動(dòng)物功能實(shí)驗(yàn)（熒光示蹤）等。歡迎咨詢400-869-2936微信同號(hào)）相關(guān)文獻(xiàn)MaS,XingX,HuangH,etal.Skeletalmuscle-derivedextracellularvesiclestransportglycolyticenzymestomediatemuscle-to-bonecrosstalk.CellMetab.2023Nov7;35(11):2028-2043.e7.相關(guān)閱讀1）Nature：癌癥患者肝臟代謝功能絮亂的元兇被發(fā)現(xiàn)2）橫跨20年，血漿外泌體miRNA預(yù)測(cè)肺功能變化軌跡3）高分案例分享｜腫瘤免疫研究的聚焦點(diǎn)——外泌體4）外泌體：預(yù)測(cè)腫瘤治療反應(yīng)的新型標(biāo)志物5）BloodCancerDiscov封面文章：外泌體研究的創(chuàng)