青霉素發(fā)酵菌種的培養(yǎng)

青霉素發(fā)酵菌種的培養(yǎng)

目前，世界上用于生產(chǎn)青霉素的高產(chǎn)菌株大多是以產(chǎn)生黃霉為原料的，并通過各種改進(jìn)途徑獲得的。青霉素的生產(chǎn)包括發(fā)酵和提取兩部分。工藝流程大致如下:菌種的保藏、孢子制備、種子制備、發(fā)酵、提取和精制1超低溫5.溫從來源于自然界土壤等,獲得能產(chǎn)生抗生素的微生物,經(jīng)過分離、選育和純化后即稱為菌種。菌種可用冷凍干燥法制備后,以超低溫,即在液氮冰箱(-190～-196℃)內(nèi)保存。所謂冷凍干燥是用脫脂牛奶或葡萄糖液等和孢子混在一起,經(jīng)真空冷凍、升華干燥后,在真空下保存。如條件不足時,則沿用砂土管在0℃冰箱內(nèi)保存的老方法,但如需長期保存時不宜用此法。一般生產(chǎn)用菌株經(jīng)多次移植往往會發(fā)生變異而退化,故必須經(jīng)常進(jìn)行菌種選育和純化以提高其生產(chǎn)能力。2培養(yǎng)抗菌液生產(chǎn)用的菌株須經(jīng)純化和生產(chǎn)能力的檢驗(yàn),若符合規(guī)定,才能用來制備種子。制備孢子時,將保藏的處于休眠狀態(tài)的孢子,通過嚴(yán)格的無菌手續(xù),將其接種到經(jīng)滅菌過的固體斜面培養(yǎng)基上,在一定溫度下培養(yǎng)5～7日或7日以上,這樣培養(yǎng)出來的孢子數(shù)量還是有限的。為獲得更多數(shù)量的孢子以供生產(chǎn)需要,必要時可進(jìn)一步用扁瓶在固體培養(yǎng)基(如小米、大米、玉米?；螓熎?上擴(kuò)大培養(yǎng)。3種子罐培養(yǎng)過程出現(xiàn)菌其目的是使孢子發(fā)芽、繁殖以獲得足夠數(shù)量的菌絲,并接種到發(fā)酵罐中,種子制備可用搖瓶培養(yǎng)后再接入種子罐進(jìn)逐級擴(kuò)大培養(yǎng)?；蛑苯訉㈡咦咏尤敕N子罐后逐級放大培養(yǎng)。種子擴(kuò)大培養(yǎng)級數(shù)的多少,決定于菌種的性質(zhì)、生產(chǎn)規(guī)模的大小和生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)。擴(kuò)大培養(yǎng)級數(shù)通常為二級。搖瓶培養(yǎng)是在錐形瓶內(nèi)裝入一定數(shù)量的液體培養(yǎng)基,滅菌后以無菌操作接入孢子,放在搖床上恒溫培養(yǎng)。在種子罐中培養(yǎng)時,在接種前有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基都必須經(jīng)過滅菌。接種材料為孢子懸浮液或來自搖瓶的菌絲,以微孔差壓法或打開接種口在火焰保護(hù)下按種。接種量視需要而定。如用菌絲,接種量一般相當(dāng)于0.1%～2%,從一級種子罐接入二級種子罐接種量一般為5%～20%,培養(yǎng)溫度一般在25～30℃。如菌種系細(xì)菌,則在32～37℃培養(yǎng)。在罐內(nèi)培養(yǎng)過程中,需要攪拌和通入無菌空氣?？刂乒逌?、罐壓,并定時取樣作無菌試驗(yàn),觀察菌絲形態(tài),測定種子液中發(fā)酵單位和進(jìn)行生化分析等,并觀察無雜菌情況。種子質(zhì)量如合格方可移種到發(fā)酵罐中。4磷酸酶生產(chǎn)的工藝控制青霉素大規(guī)模生產(chǎn)是采用三級發(fā)酵,其目的主要是使青霉菌軍體數(shù)量逐步擴(kuò)大和適應(yīng)發(fā)酵,其次是使發(fā)酵罐連續(xù)使用,縮短發(fā)酵周期。4.1碳和氮資源的影響和控制4.1.1最佳碳源的確定青霉菌能利用多種碳源,如乳糖、蔗糖、葡萄搪、甘露糖、淀粉以及天然油脂等。葡萄糖是容易利用的碳源,有利于菌體的生長;乳糖是青霉素生物合成最好的碳源。青霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中采用葡萄糖和乳糖兩種碳源就能適合青霉菌發(fā)酵過程中的生理變化、在發(fā)酵初期利用氧化速率快的葡萄糖使青霉素大量、迅速、強(qiáng)壯地繁殖菌絲體;當(dāng)葡萄糖耗盡時青霉菌進(jìn)入發(fā)酵后期,此時利用氧化緩慢的乳糖,使發(fā)酵液pH較穩(wěn)定,避免速效碳源的分解產(chǎn)物阻遏作用,有利于青霉菌大量、持久地分泌青霉素。4.1.2前體結(jié)構(gòu)的合成玉米漿是青霉素發(fā)酵最好的氮源,因?yàn)橛衩诐{含有多種氨基酸,如精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸以及青霉素生物合成的前體苯乙酸及其衍生物。由于玉米漿的質(zhì)量難以控制,也可選用便于保藏和質(zhì)量穩(wěn)定的花生餅粉或棉籽餅粉來代替。4.2復(fù)合基質(zhì)補(bǔ)料基質(zhì)濃度在分批發(fā)酵中,常常因?yàn)榍捌诨|(zhì)量濃度過高,對生物合成酶系產(chǎn)生阻遏或?qū)z生長產(chǎn)生抑制,而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長和產(chǎn)物合成,為了避免這一現(xiàn)象,在青霉素發(fā)酵中通常采用補(bǔ)料分批操作法,即對容易產(chǎn)生阻遏、抑制和限制作用的基質(zhì)進(jìn)行緩慢流加以維持一定的最適濃度。這里必須特別注意的是葡萄糖的流加,因?yàn)榧词故浅鲎钸m濃度范圍較小的波動,都將引起嚴(yán)重的阻遏或限制,使生物合成速度減慢或停止。4.3ph值的變化青霉素發(fā)酵的最適pH值一般認(rèn)為在6.5左右,有時也可以略高或略低一些,但應(yīng)盡量避免pH值超過7.0,因?yàn)榍嗝顾卦趬A性條件下不穩(wěn)定,容易加速其水解。在緩沖能力較弱的培養(yǎng)基中,pH值的變化是葡萄糖流加速度高低的反映。過高的流加速率造成酸性中間產(chǎn)物的積累使pH值降低;過低的加糖速率不足以中和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的氨或其他生理堿性物質(zhì)代謝產(chǎn)生的堿性化合物而引起pH值上升。4.4分段變溫控制法青霉菌生長的適宜溫度為30℃,而分泌青霉素的適宜溫度是20℃左右,通常采用分段變溫控制法,使溫度適合不同階段的需要。如采用從26℃逐漸降至22℃的發(fā)酵溫度,可延緩菌絲衰老,增加培養(yǎng)液的溶解氧濃度,延長發(fā)酵周期,有利于發(fā)酵后期青霉素單位的增長,減少發(fā)酵液中青霉素的降解破壞,提高產(chǎn)量。4.5泡沫發(fā)酵過程泡沫較多,需補(bǔ)入消沫劑。天然油脂:玉米油;化學(xué)消沫劑:泡敵。少量多次。不適在前期多加入,影響呼吸代謝。5提取青霉素的工藝5.1采用板框壓濾機(jī)，液滲流下青霉素發(fā)酵液過濾宜采用鼓式真空過濾器,如采用板框壓濾機(jī)則菌絲常流入下水道而影響廢水治理。且勞動強(qiáng)度大,并對環(huán)境衛(wèi)生不利。過濾前加去乳化劑并保溫。5.2待萃取藥物分離青霉素的提取采用溶媒萃取法。將發(fā)酵濾液酸化至PH久后加相當(dāng)于發(fā)酵濾液體積1/3的醋酸丁酯,混合后以碟片式離心機(jī)分離。為提高萃取效率將兩臺離心機(jī)串連使用,進(jìn)行二級對向逆流萃取。得一次醋酸丁酯提取液。然后以1.3%～1.9%NaHCO3在pH6.8～7.1條件下將青霉素從醋酸丁酯提取到緩沖液中。然后調(diào)pH至2.0后,再一次將青霉素從緩沖液轉(zhuǎn)入到醋酸丁酯中去,其方法同上。得到二次醋酸丁酯提取液。5.3去看看那個萃取液中加活性炭150～300g/10億單位,進(jìn)行脫色、過濾。5.4koh溶液的絡(luò)合萃取青霉素鉀鹽在醋酸丁酯中溶解度很小,在二次丁酯萃取液中加入醋酸鉀-乙醇溶液,青霉素鉀鹽就結(jié)晶析出。然后采用重結(jié)晶方法,進(jìn)一步提高純度,將鉀鹽溶于KOH溶液,調(diào)pH至中性,加無水丁醇,在真空條件下,共沸蒸餾結(jié)晶得純品。直接結(jié)晶:在2次乙酸丁酯萃取液中加醋酸鈉-乙醇溶液反應(yīng),得到結(jié)晶鈉鹽。加醋酸