纖維素酶的檢測方法新

纖維素酶的檢測辦法摘要：本文重要介紹了纖維素酶的降解原理，通過實驗比較了四種慣用纖維素酶的檢測辦法的穩(wěn)定性，以及纖維素酶的發(fā)展前景，為纖維素酶的應用提供了進一步的參考價值。核心詞：纖維素酶酶活測定葡萄糖回歸方程一、纖維素酶及其降解原理纖維素是高等植物細胞壁的重要成分，占植物總干重的30%-50%，是地球上分布最廣，含量最豐富的可再生性碳源化合物，占地球總生物量的40%。據(jù)報道，我國每年光作物秸稈，稻梗等含纖維素較豐富的物質(zhì)就有5億噸之多，全球每年通過光合作用產(chǎn)生的植物物質(zhì)高達噸，其中尚有89%未被人們運用，而大量的秸稈，稻梗等含纖維素豐富的物質(zhì)的運用率也很低。大多采用燃燒的方式來解決，這樣就造成了環(huán)境污染，破壞了土壤的理化性質(zhì)和喪失了有機質(zhì)成分。因此，纖維素的充足運用與有效的轉化對于解決現(xiàn)在的能源危機，糧食短缺，環(huán)境污染等有重大意義。纖維素酶是分解纖維素的一類酶，它能將纖維素分解為葡萄糖，充足的運用了纖維素。自19Sellieres在蝸牛消化液中發(fā)現(xiàn)纖維素酶以來，纖維素酶的研究和應用受到了國內(nèi)外學者的極大關注，獲得了很大進展?，F(xiàn)在，國內(nèi)外學者通過篩選產(chǎn)酶菌株來發(fā)酵產(chǎn)酶，再應用纖維素酶到食品，醫(yī)藥，飼料，洗滌等工業(yè)中，不僅解決了纖維素的再運用問題還獲得了很可觀的經(jīng)濟效益。纖維素酶是由許多含有高協(xié)同作用的水解酶構成的。習慣上將纖維素酶分成三種重要成分：內(nèi)切酶（內(nèi)切β-1,4-葡萄糖酶，也稱Cx酶）、外切酶（外切β-1,4葡萄糖酶，也稱C1酶）、β-1,4葡萄糖酶（即為纖維二糖酶）[1]。C1酶重要作用于天然纖維素，使之轉變?yōu)榉墙Y晶的纖維素。Cx酶又分為Cx1酶和Cx2酶。Cx1酶是一種內(nèi)斷型纖維素酶，它從水合非結晶纖維素分子內(nèi)部作用于β-（1,4）糖苷鍵，生成纖維糊精和纖維二塘。Cx2酶是一種外斷型纖維素酶，它從水合性纖維素分子的非還原端作用于β-（1,4）糖背鍵，逐步切斷β-（1,4）糖節(jié)鍵生成葡萄糖。纖維二糖酶則作用于纖維二糖，生成葡萄糖。纖維素酶在降解纖維素過程中的作用機理至今還不是很清晰?，F(xiàn)在有關Cx酶、C1酶和β-1,4葡萄糖酶這3種酶的作用機理的假說比較公認的是下列3種，其中協(xié)同理論最為廣泛接受。（1）C1-Cx假說。該理論認為首先由C1酶作用于纖維素酶的結晶區(qū)，再由外切酶和β-葡萄糖苷酶聯(lián)合作用產(chǎn)生二糖和葡萄糖。其水解模式如圖1所示。圖1C1-Cx假說示意（2）次序作用假說。該假說認為首先由內(nèi)切酶隨機的作用于纖維素的葡萄糖苷鍵，打開缺口，然后由外切酶在新生鍵末端切下一種纖維二糖，再由β-葡萄糖苷酶將它水解成葡萄糖。（3）協(xié)同作用假說。該理論認為是內(nèi)切葡萄糖酶首先攻打纖維素的非結晶區(qū)，形成外切纖維素酶需要的新的游離末端，然后外切纖維素酶從多糖鏈的非還原端切下纖維二糖單位，β-葡萄糖苷酶再水解纖維二糖單位形成葡萄糖。二、纖維素酶的檢測辦法纖維素酶各組分的底物專一性不同，并且纖維素酶是多組分復合物。纖維素酶作用的底物也比較復雜，同時不同來源的纖維素酶其構成及各組分的比例有較大的差別，致使纖維素酶活力的測定辦法復雜而不統(tǒng)一。其中重要的檢測辦法有：棉線切斷法，濾紙崩潰法，羧甲基纖維素鈉為底物的粘度減少和還原糖增加的測定法[2]，分光光度計法[3]，快速測定纖維素酶CMC液化活力法[4]，平板法，巴魯阿-斯溫(Bamchandswain)測定法[5]。對于細菌等對纖維素分解能力強的微生物，由于對其酶的形成、分泌和作用機制研究較少，這些測定辦法不一定合用。但現(xiàn)在對于這些辦法測定的具體數(shù)值的可信度、可比性，卻沒有有關的報道研究。下面重要通過四種辦法進行實驗，研究這些實驗辦法的穩(wěn)定性，從而為實驗研究提供一定的參考根據(jù)[6]。、材料與辦法材料：重要儀器HH-6型恒溫水浴鍋；22PC型分光光度計；HG1001型電熱鼓風干燥箱；FA型電子分析天平；UV-2401型紫外雙光束分光光度計實驗辦法：試劑的配備：（1）醋酸-醋酸鈉緩沖液：冰醋酸定容至100ml，稱取27,2g的醋酸鈉溶解并定容至100ml將上述兩種溶液等體積混合。（2）3,5-二硝基水楊酸溶液（DNS）：稱取3,5-二硝基水楊酸于500ml大燒杯中，用少量蒸餾水溶解后加入2mol/mlNaOH溶液262ml，再加入到500ml含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結晶酚和5g無水亞硫酸鈉攪拌溶解，冷卻后移入1000ml容量瓶中，用蒸餾水定容至1000ml，貯于棕色瓶中，室溫放置一周后使用。（3）CMC-Na溶液：稱取羧甲基纖維素鈉，加熱溶解，定容至100ml[7]。酶活測定辦法葡萄糖原則曲線的繪制原理：3,5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范疇內(nèi)還原糖的量和反映液的強度成比例關系，運用分光光度計測出其在520nm處的吸光度，得出還原糖的量。葡萄糖原則溶液的配制：將葡萄糖放在110℃烘箱中烘2h至恒重，稱取烘好的葡糖糖，溶解并定容至100ml。取16支具塞試管，依次編號為0,1,2,3,4,5,6,7并作平行實驗。由于多個辦法反映體系的總體積不同，因此需作不同的原則曲線，所加的量也有所不同。現(xiàn)以總體積為9ml體系為例：表1葡萄糖原則曲線繪制辦法管號01234567葡萄糖量（ml）0123蒸餾水（ml）7654DNS(ml)22222222搖勻后置于沸水浴中加熱5min后，冷卻定容至25ml。搖勻后以0號管為對照于最大吸取波優(yōu)點測定OD值，以葡萄糖含量μmol為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制原則曲線。酶活測定辦法的比較配制不同濃度的原則酶液：用去離子水100ml來溶解100mg纖維素酶（≥1000IU），配制成1mg/ml酶液。測定時分別吸取，，，，，上述酶液用水補足至1ml即為不同濃度的酶液。（1）濾紙酶活（FPA）測定辦法濾紙是聚合度和結晶度都居“中檔”的纖維性材料，以其為底物經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖的量來表征纖維素酶系總的糖化能力的辦法，此辦法應用廣泛，它反映了三類酶組分的協(xié)同作用，統(tǒng)稱濾紙酶活（FilterPaperActivity，F(xiàn)PA）辦法：取1ml酶液加1mlL、的醋酸緩沖液，預熱到50℃，加入1條1x6cm新華濾紙（50±1mg），50℃保溫1h。取出，沸水浴滅活5min，冷卻至室溫，用3mlDNS試劑顯色后稀釋3倍，測OD值（520nm）。OD值越大，闡明該菌株的酶活力越強[8]。酶活力計算：從原則曲線中查出葡萄糖μmol數(shù)；酶活力（其中：60為保溫時間（酶與底物作用時間，min）；Ew為粗酶液的體積（ml）；μ是指在特定條件下，每分鐘催化纖維素水解成1μmol葡萄糖的酶量。（2）羧甲基纖維素鈉鹽（CMC-Na）酶活性測定辦法原理：纖維素酶對CMC-Na有降解能力，生成葡萄糖等還原糖，再用DNS法顯色，用原則葡萄糖溶液作原則液，22PC分光光度計在520nm處測其吸光度，以每分鐘生成相稱于1μmol的葡萄糖為一種酶活性單位。取3支帶有20ml刻度的試管，1支管作空白對照，2支管作平行樣品管。每支樣品管中加1ml酶溶液，置于50℃水浴鍋中預熱2min，然后在3支試管中分別加入4ml已預熱至50℃的底物溶液，精確計時5min取出，每管立刻分別加入1ml2mol/L氫氧化鈉溶液和2mlDNS顯色液，搖勻后在對照管中再加入1ml酶液。將3支試管放入沸水浴中，5min后立刻取出，流水冷卻，用蒸餾水定容至20ml，于520nm處測OD值。酶活力計算：從原則曲線中查出葡萄糖μmol數(shù)；酶活力（其中：5為保溫時間（酶與底物作用時間，min）；Ew為粗酶液的體積（ml）；μ是指在特定條件下，每分鐘催化纖維素水解成1μmol葡萄糖的酶量。（3）染色纖維素測定辦法[9]用考馬斯亮藍使濾紙染色酶解后在最大吸取波優(yōu)點測釋放的著色物的吸光值，代表酶活，以吸光度為縱坐標，酶濃度為橫坐標做曲線。在實際測定時，先運用紫外雙光束分光光度計進行波長掃描，發(fā)現(xiàn)其在536nm處吸取峰最高，因此在實驗時以此波長作為測定波長。（4）CMC粘度減少測定辦法底物溶液9ml，加酶液1ml，40℃，測定底物粘度減至二分之一時所需時間，以奧氏粘度計測定。以10min能使底物粘度減少二分之一的酶活作為一種單位。成果與分析葡萄糖原則曲線繪制實驗中所用的原則葡萄糖曲線繪制成果以下：由于在后來的測定中，各辦法的反映體系并不相似，因此每個體系須有各自的葡糖糖原則曲線作為此后的參考。CMC糖化力測定參考圖1，有三條曲線，是由于在慣用測定中酶與底物不同，而造成它們各自體系的溶液的總體積也不相似，因此此辦法的葡萄糖原則曲線有三條。濾紙法參考圖2。圖1CMC酶活測定法葡糖糖原則曲線(不同體系)所得三條曲線的回歸方程以下：y1=圖2濾紙法葡糖糖原則曲線所得曲線的回歸方程：y=原則纖維素酶酶活曲線酶活測定辦法成果比較以下：表2原則纖維素的CMC酶活力和濾紙酶活力測定成果CMC酶活力測定法濾紙酶活力測定法（FPA）含酶量（mg/mL）OD值查得葡萄糖量（μmol）酶活（U/mL）OD值查得葡萄糖量（μmol）酶活（U/mL）0000000所得曲線的回歸方程:y=R2=y=R2=實驗成果表明：用原則纖維素酶所做的CMC酶活測定和濾紙酶活測定，從回歸曲線能夠看出他們的線性較好，能夠充足闡明這2種辦法比較穩(wěn)定。并且CMC酶活測定法和濾紙酶活測定法在諸多報道中均在采用，這樣使實際實驗的成果更具可比性。所得曲線的回歸方程：y=所得曲線的回歸方程：y=由上述成果可知：CMC粘度減少法的線性沒有濾紙酶活測定法和CMC酶活測定法來得好，并且在實驗過程中，兩個平行實驗之間有較大的誤差。但從回歸方程就能看出，該辦法的穩(wěn)定性較其它3種辦法有很大的偏差。表3原則纖維素的CMC粘度減少法和染色纖維素法測定成果CMC粘度減少法染色纖維素法含酶量（mg/mL）所用時間（min）酶活（U/mL）OD值酶量（mg）00000結論本次實驗研究了纖維素酶測定辦法中慣用的4種辦法，即：FPA測定法、CMC-Na酶活性測定法、染色纖維素測定法以及CMC粘度減少測定法，比較了這4種辦法測定的線性有關性以及穩(wěn)定性，通過實驗研究表明，F(xiàn)PA測定法和CMC-Na酶活性測定法較穩(wěn)定，線性有關性較高，能夠作為研究測定的可靠辦法。三、纖維素酶的應用與發(fā)展趨勢纖維素酶可廣泛用于食品、紡織、飼料、釀酒、石油勘探、中藥成分提取等眾多領域，特別是在紡織、洗滌、造紙、和生物能源等工業(yè)應用上含有重要地位。自20世紀90年代開始，酸性纖維素酶用于牛仔布的水洗整頓(biostoningandbiofinishing)，從而開始了纖維素酶在工業(yè)上的大規(guī)模應用，這也是現(xiàn)在纖維素酶應用最成功、用量最大的領域。在牛仔布的水洗整頓上酸性纖維素酶含有用量少、效果快的特點，但服裝返染嚴重；中性纖維素酶反映條件溫和并且不易返染，織物檔次得到提高，已普遍替代酸性酶。但在棉織物的整頓上，如去球(depilling)脫毛(reducedfuzz)以及增柔(softness)等，酸性纖維素酶特別是木霉產(chǎn)生的纖維素酶仍含有更多的優(yōu)勢。運用纖維素酶對棉織物的整頓并不需要纖維素酶的全部組分，如進行棉織物的脫毛、去球等整頓，僅有內(nèi)切酶就可產(chǎn)生明顯的效果，但是棉織物的減量也較嚴重，影響了織物的強度，通過基因工程變化內(nèi)切酶和外切酶的比例，能夠在一定程度上解決這個問題。纖維素酶用于造紙工業(yè)，是運用外切纖維素酶只從末端切斷纖維素的作用原理，提高紙張的光潔度。堿性纖維素酶用于洗滌劑工業(yè)，能夠提高棉織物的洗凈度，起重要作用的是內(nèi)切酶(CMC酶)，是近些年來洗滌劑工業(yè)競相開發(fā)的新酶種之一。這兩種工業(yè)應用涉及的纖維素酶只需要纖維素酶系中的單一組分，基因工程技術能夠在其中得到廣泛的應用。纖維素酶將來最大的用途，或者能夠使其產(chǎn)量得到巨大增加的工業(yè)需求將是纖維素乙醇的開發(fā)。自上世紀70年代石油危機以來，世界各國都致力于開發(fā)新的可再生能源，而生物乙醇(bioeth-anol)是被普遍看好的新型燃料。進入21世紀，運用纖維素酶轉化纖維素物質(zhì)產(chǎn)生葡萄糖進而發(fā)酵獲得生物乙醇，能夠避免對糧食作物的大量損耗，引發(fā)了各國政府和研究機構的重視，這其中的核心是纖維素酶的成本問題。由于纖維素酶發(fā)酵活力較低，因此其應用成本也較高。同時纖維素酶相比其它糖苷水解酶類，比活力最少要低1~2個數(shù)量級，如濾紙酶的比活力為1IU/mg左右，CMC的比活力約為10IU/mg，從而造成酶的作用效率較低。這是兩個限制纖維素酶應用的瓶頸問題，也是纖維素酶研究的熱點與難點?，F(xiàn)在通過傳統(tǒng)的菌種誘變和基因工程技術能夠較大幅度地提高目的蛋白的體現(xiàn)量，從而提高酶的發(fā)酵水平，如諾維信公司與美國能源部合作，將制造纖維素乙醇中的酶制劑成本由的每加侖5美元減少到的30美分，又減少到每加侖18美分。還能夠通過改善發(fā)酵條件和工藝，如采用固體發(fā)酵來大幅度減少發(fā)酵成本。但是提高酶降解天然纖維素的效率則需要，進一步研究纖維素酶的構造與功效以及作用方式，進而對其進行有效改造;或者通過篩選新的產(chǎn)酶菌種，發(fā)現(xiàn)含有開發(fā)潛力的新酶源?？傊?，纖維素酶