絲裂霉素c治療準(zhǔn)分子激光屈光性角膜切削術(shù)后角膜上皮下霧狀混淆作用的實(shí)驗(yàn)研究

絲裂霉素c治療準(zhǔn)分子激光屈光性角膜切削術(shù)后角膜上皮下霧狀混淆作用的實(shí)驗(yàn)研究

準(zhǔn)分子激光折疊成像（prk）切割組織準(zhǔn)確，安全性好，預(yù)測(cè)性好，光譜穩(wěn)定。它已成為治療中、低度視力改善的主要方法，并取得了良好的效果。然而,該手術(shù)存在的主要問題是角膜上皮下霧狀混濁(haze),它不僅影響術(shù)后視力而且造成屈光回退,亟待解決。本實(shí)驗(yàn)通過局部應(yīng)用0.2g·L-1絲裂霉素C(mitomycinC,MMC)溶液滴眼,并與1.0g·L-1地塞米松溶液進(jìn)行對(duì)比,觀察藥物對(duì)PRK后haze形成的影響,以尋找一種新的防治haze安全有效的方法。1材料和方法1.1下其它大鼠眼新西蘭白兔41只(由南京軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重2.1～3.0kg,無眼部病變,雌雄兼用,隨機(jī)分為3組,每組27眼。Ⅰ組為MMC組,Ⅱ組為地塞米松組,Ⅲ組為對(duì)照組。1.2jcm-2加削法30g·L-1戊巴比妥鈉全麻兔后,用PTK法(頻率13.0Hz,能量密度180mJ·cm-2)去除角膜中央8mm直徑上皮。然后行PRK,切削參數(shù):-9.00D,深度97μm,直徑7mm,頻率10Hz,能量密度120mJ·cm-2。使用激光器為美國Coherent公司生產(chǎn)的SchwindKeratom-F型準(zhǔn)分子激光治療機(jī)。1.3l-2mmc/l-1地塞米松滴眼術(shù)畢所有眼涂金霉素眼膏。術(shù)后第1天始,Ⅰ組用0.2g·L-1MMC滴眼,每日4次,共14d;Ⅱ組用1.0g·L-1地塞米松滴眼,術(shù)后1～4周,每日4次,術(shù)后5～8周,每日2次;Ⅲ組滴平衡鹽液,每日4次,共14d。1.4術(shù)后觀察1.4.1皮質(zhì)愈合時(shí)間每天觀察眼前段情況,滴10g·L-1熒光素鈉染色檢查角膜上皮直至其完全愈合,記錄角膜上皮愈合時(shí)間。術(shù)后1、4、8周檢查haze情況,同時(shí)攝取角膜像,按Fants等級(jí)分類法分5級(jí)并記分,即0級(jí)為0分,0.5級(jí)為0.5分,1～4級(jí)分別為1～4分。1.4.2膜成像及內(nèi)科醫(yī)生術(shù)后1、4、8周行角膜中央內(nèi)皮檢查,觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞密度、六角形細(xì)胞百分率及細(xì)胞面積變異系數(shù)。1.4.3標(biāo)準(zhǔn)染色—光學(xué)顯微鏡檢查術(shù)后1、4、8周隨機(jī)活殺兔取術(shù)區(qū)角膜,其1/2置于100g·L-1中性甲醛液固定,常規(guī)石蠟切片,HE染色。觀察角膜上皮再生、基質(zhì)成纖維細(xì)胞及纖維排列情況。1.4.4透射電鏡檢查取上述角膜片的另1/2浸于25g·L-1戊二醛液固定。觀察角膜組織的超微結(jié)構(gòu)改變。1.5ze積分的差異所有數(shù)據(jù)采用SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。用秩和檢驗(yàn)分析各組haze積分的差異。角膜上皮愈合時(shí)間、內(nèi)皮細(xì)胞密度、內(nèi)皮細(xì)胞面積的變異系數(shù)、內(nèi)皮六角形細(xì)胞百分率等數(shù)據(jù),用單因素方差分析進(jìn)行總體均數(shù)的顯著性檢驗(yàn),對(duì)有差異者采用q檢驗(yàn)分別進(jìn)行2組間均數(shù)的顯著性檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1審查中的裂縫燈2.1.1膜過渡時(shí)間3組均于術(shù)后5～6d完全愈合,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無顯著性(P>0.05)。2.1.2各組haze普遍加重術(shù)后1周,各組haze積分平均值均為0～0.5分,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無顯著性(P>0.05)。術(shù)后4周,各組haze普遍加重,術(shù)后8周仍明顯,均以Ⅲ組為最明顯(P<0.05),Ⅰ、Ⅱ組差異無顯著性(P>0.05)。各組不同時(shí)間段haze積分平均值變化見表1。2.2前基質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖情況術(shù)后1周,Ⅰ組和Ⅱ組可見4～6層上皮細(xì)胞,上皮形狀及排列較規(guī)則,前基質(zhì)層見中等量成纖維細(xì)胞,纖維排列較整齊;而Ⅲ組可見5～7層上皮細(xì)胞,上皮細(xì)胞排列紊亂、形狀各異,前基質(zhì)成纖維細(xì)胞明顯增多,呈活躍增殖狀態(tài),纖維排列紊亂,新生基質(zhì)厚度大于Ⅰ組和Ⅱ組。術(shù)后4周,Ⅲ組上皮細(xì)胞7～9層,基底細(xì)胞大小不一,呈不規(guī)則柱狀結(jié)構(gòu),前基質(zhì)成纖維細(xì)胞明顯增多,功能活躍,膠原纖維增生、排列紊亂明顯,纖維間隙較大;Ⅰ組和Ⅱ組上皮細(xì)胞5～7層,細(xì)胞大小基本均勻,前基質(zhì)成纖維細(xì)胞數(shù)較術(shù)后1周時(shí)為多,但明顯少于Ⅲ組,纖維排列輕度紊亂。術(shù)后8周,光鏡下改變基本同第4周。3組不同時(shí)間段后基質(zhì)層、Descement膜和內(nèi)皮層均未見異常。2.3膠原纖維的形態(tài)變化術(shù)后1周,Ⅲ組上皮基底細(xì)胞異常增大,核分裂像增多,上皮細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、明顯腫脹的線粒體及呈網(wǎng)狀分布的微絲;前基質(zhì)見大量成纖維細(xì)胞,細(xì)胞肥大、胞漿豐富,胞漿內(nèi)空泡形成。擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多明顯,線粒體腫脹,高爾基體發(fā)達(dá),且含有豐富的微管、微絲。核淡染,染色質(zhì)著邊,細(xì)胞周圍可見新合成的膠原纖維,其粗大、疏松、排列紊亂,呈交叉排列。Ⅰ組和Ⅱ組電鏡下改變基本相同,與Ⅲ組比較上皮細(xì)胞核較少見,細(xì)胞分裂無亢進(jìn),細(xì)胞內(nèi)可見中等量細(xì)胞器,前基質(zhì)成纖維細(xì)胞數(shù)較少、核分裂像不明顯,膠原纖維排列輕度紊亂。術(shù)后4周,Ⅲ組上皮基底細(xì)胞仍增大,前基質(zhì)仍有大量增生活躍的成纖維細(xì)胞,細(xì)胞周圍可見較多排列紊亂的膠原纖維,粗細(xì)不均、分布疏松,失去了板層結(jié)構(gòu),瘢痕形成。Ⅰ組和Ⅱ組上皮基底細(xì)胞核分裂像仍可見但不及Ⅲ組明顯,前基質(zhì)成纖維細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器明顯減少,纖維排列較Ⅲ組明顯整齊。術(shù)后8周,Ⅲ組前基質(zhì)仍有較多成纖維細(xì)胞,形態(tài)向扁平型恢復(fù),但增生仍活躍,胞漿內(nèi)仍見較多腫脹的線粒體及擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),細(xì)胞周圍纖維排列仍紊亂。Ⅰ組和Ⅱ組纖維排列較整齊但纖維粗細(xì)欠均勻,前基質(zhì)成纖維細(xì)胞較少,增生不活躍。3組各時(shí)間段后部基質(zhì)、Descement膜及內(nèi)皮層均末示異常。2.4不同形態(tài)細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞密度、細(xì)胞密度及六角形細(xì)胞率術(shù)前及術(shù)后1、4、8周,3組角膜正中內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞面積變異系數(shù)及六角形細(xì)胞率均無明顯改變(表2～4)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,3組間差異無顯著性(P>0.05)。3prk治療haze的臨床應(yīng)用角膜haze是PRK后主要并發(fā)癥,往往伴隨屈光回退,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致視力和對(duì)比敏感度降低,影響PRK手術(shù)的預(yù)測(cè)性和穩(wěn)定性,因而日益受到人們關(guān)注。目前臨床上普遍應(yīng)用皮質(zhì)類固醇激素滴眼,但其效果尚存在爭議,且長期應(yīng)用可引起激素性青光眼、白內(nèi)障等一系列嚴(yán)重并發(fā)癥,因此有必要尋找一種更為安全有效的藥物。目前對(duì)PRK后角膜傷口愈合過程的研究表明,haze形成的主要原因?yàn)?上皮過度增殖,前基質(zhì)成纖維細(xì)胞數(shù)量增多且合成功能活躍,有新的細(xì)胞外基質(zhì)合成以及新生膠原纖維排列紊亂。因而適當(dāng)?shù)貙?duì)其傷口愈合進(jìn)行調(diào)節(jié)有助于減輕haze的形成和發(fā)展。MMC是一種烷化劑,能破壞DNA結(jié)構(gòu)和功能,并抑制RNA的合成,尤其是對(duì)合成前期和合成期最敏感,抑制作用較強(qiáng),因而能阻止成纖維細(xì)胞增殖及產(chǎn)生膠原物質(zhì),防止瘢痕形成。國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道低濃度即0.2g·L-1絲裂霉素C滴眼,很少發(fā)生并發(fā)癥,使用安全,已應(yīng)用于防治青光眼濾過性手術(shù)后濾過泡瘢痕形成、胬肉切除術(shù)后復(fù)發(fā)及防止淚道探通術(shù)、淚囊鼻腔吻合術(shù)后再阻塞,并取得顯著效果。張建華等的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MMC對(duì)PRK后兔角膜成纖維細(xì)胞生長有強(qiáng)烈的抑制作用。為此我們于PRK后局部應(yīng)用MMC。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PRK后應(yīng)用0.2g·L-1MMC溶液滴眼,治療組角膜上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的過度增殖及膠原纖維合成均受抑制,haze程度減輕;與應(yīng)用1.0g·L-1地塞米松滴眼治療相比,其減輕haze的作用相似,說明MMC可通過抑制角膜上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的過度增生及膠原纖維的合成,從而減輕haze的形成。Palmer經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)0.2g·L-1MMC并不產(chǎn)生臨床上的角膜上皮毒性作用。我們通過裂隙燈顯微鏡、光鏡、電鏡及角膜內(nèi)皮鏡等檢查,均未發(fā)現(xiàn)此劑量MMC對(duì)角膜的副作用,而且角膜上皮