茶樹內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)及混合培養(yǎng)的抑菌活性

茶樹內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)及混合培養(yǎng)的抑菌活性

大多數(shù)植物與生殖器有共生關(guān)系（rodriguez等人，2009）。在與宿主植物的共生過程中,內(nèi)生真菌與宿主細(xì)胞相互作用而協(xié)同進(jìn)化,從而對(duì)植物的營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)發(fā)育、生態(tài)適應(yīng)性和與之相聯(lián)系的生物多樣性產(chǎn)生重要的影響。近年來的研究表明,一些內(nèi)生真菌能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的抗性次生代謝產(chǎn)物,成為篩選植物病蟲害生防因子的新來源,因而受到廣泛的關(guān)注(Backman&Sikora2008;Mejiaetal.2008)。很多生物過程是單種微生物不能完成或只能微弱地進(jìn)行的,必須依靠?jī)煞N或兩種以上微生物的共同培養(yǎng)才能完成?；旌吓囵B(yǎng)時(shí)各菌之間可能發(fā)生直接或間接的相互作用,互相提供所需的營(yíng)養(yǎng),轉(zhuǎn)移或消除抑制產(chǎn)物,或通過一些物理或生化機(jī)制刺激彼此間的生理活性(Holguin&Bashan1996)。例如:黃綠木霉、黑曲霉及綠色木霉3菌混合培養(yǎng)6d后,與各菌株單獨(dú)培養(yǎng)相比,產(chǎn)纖維素酶能力最強(qiáng)(林志偉等2009)。本文比較了茶樹內(nèi)生真菌長(zhǎng)枝木霉TrichodermalongibrachiatumCSN-18和曲霉Aspergillussp.CSN-3在單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)條件下的抗真菌作用,旨在為茶樹內(nèi)生真菌混合制劑的研制提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1茶樹葉片的制備長(zhǎng)枝木霉TrichodermalongibrachiatumCSN-18分離自2005年10月2日采于福建省安溪縣官橋鎮(zhèn)草坂村茶園的健康茶樹葉片,該菌株能在茶樹葉片組織內(nèi)定殖而與茶樹建立共生關(guān)系(武漢琴等2009);曲霉AspergillusspCSN-3分離自2005年4月4日采于福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)茶園的健康茶樹葉片,是茶樹內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌株。1.1.2菌株和培養(yǎng)基稻瘟病菌Magnaporthegrisea、茶花褐斑病菌Phyllostictacamelliaecola、茶云紋葉枯病菌Guignardiacamellia、茶輪斑菌Pestallozziatheae、茶炭疽病菌Gloeosporiumtheae-sinensis、黃瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum、三七根腐病菌Cylindrocarpondestructans、白菜炭疽病菌Colletotrichumhigginsianum等菌種由福建師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。1.2方法1.2.1馬鈴薯葡萄糖pd的制備及抗菌活性的測(cè)定采用對(duì)峙培養(yǎng)法研究?jī)?nèi)生真菌之間的相互關(guān)系。內(nèi)生真菌菌株在PDA上活化培養(yǎng)6d后,取直徑為0.5cm菌絲塊接種于PDA平板上距中心2cm處同一直線的兩點(diǎn)上,同時(shí)設(shè)置單菌培養(yǎng)為對(duì)照,每個(gè)處理3次重復(fù),28℃恒溫培養(yǎng),觀察兩菌之間的相互關(guān)系(紀(jì)麗蓮等2004)。液體培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖(PD)培養(yǎng)液,設(shè)置以上兩菌的單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng),觀察、記錄培養(yǎng)過程中菌體形態(tài)、培養(yǎng)液顏色和氣味的變化。1.2.2混合培養(yǎng)原液的制備及抗菌活性的測(cè)定:設(shè)置以上兩菌的單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)。培養(yǎng)7d后的木霉和曲霉以1:1的接種量接入馬鈴薯葡萄糖(PD)培養(yǎng)液中,160r/min、28℃培養(yǎng)5d,設(shè)單菌培養(yǎng)為對(duì)照。培養(yǎng)完成后,過濾、離心,取上清液,用濾膜孔徑為0.22μm的細(xì)菌過濾器在無菌的條件下過濾,得培養(yǎng)液原液。取培養(yǎng)原液各5mL與10mL融化的PDA培養(yǎng)基混勻,倒入無菌培養(yǎng)皿中制成含培養(yǎng)液的培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)基凝固后,在每個(gè)培養(yǎng)基平面放入1塊直徑為0.5cm的供試病原菌菌餅,每處理3次重復(fù),同時(shí)以單獨(dú)培養(yǎng)的培養(yǎng)液和無菌水兩者作為對(duì)照。培養(yǎng)96h后,用十字交叉法測(cè)定供試菌菌落直徑(mm),計(jì)算抑制率(方中達(dá)1998;Campanileetal.2007)。1.2.3供試植物病原菌的培養(yǎng)設(shè)置以上兩菌的單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)。取1.0L培養(yǎng)原液用等體積的乙酸乙酯萃取2次,將萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45℃濃縮蒸干,得黃色浸膏;用乙酸乙酯溶解此浸膏,制得濃度為1mg/mL的濃縮液。供試的植物病原真菌活化培養(yǎng)后,用打孔器取直徑0.5cm菌塊接種于PDA平板中央,然后在菌塊兩邊1.5cm處各放一個(gè)牛津杯,把混合培養(yǎng)液的乙酸乙酯萃取液100μL注入牛津杯中,置于28℃恒溫培養(yǎng),每個(gè)處理3次重復(fù),同時(shí)以長(zhǎng)枝木霉CSN-18和曲霉CSN-3單獨(dú)培養(yǎng)液的乙酸乙酯萃取液及乙酸乙酯為對(duì)照。比較混合培養(yǎng)的乙酸乙酯萃取液對(duì)8種供試植物病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響。抑制率的計(jì)算方法同上。1.2.4枯草原螯蝦培養(yǎng)方對(duì)病原真菌孢子萌發(fā)的抑制作用采用懸滴法(方中達(dá)1998),設(shè)置以上兩菌的單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)。培養(yǎng)、收集供試植物病原真菌的孢子配置孢子懸浮液,在10×10顯微鏡倍下,每個(gè)視野有50-60個(gè)孢子,以無菌水作為對(duì)照。各取一滴滴加到凹玻片上,將凹玻片迅速翻轉(zhuǎn)使液滴倒懸在凹玻片表面,使液滴倒懸在保濕的小環(huán)境中,每個(gè)處理3次重復(fù)。28℃下培養(yǎng)8h后檢查孢子萌發(fā)的情況,計(jì)算孢子萌發(fā)率。混合培養(yǎng)原液對(duì)茶花褐斑病菌孢子的抑制作用,則以不同濃度的培養(yǎng)原液配成適當(dāng)濃度的孢子懸浮液,方法同上。1.2.5培養(yǎng)時(shí)間對(duì)茶褐斑病菌的抑菌活性測(cè)定根據(jù)培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液顏色的變化情況,在相同的培養(yǎng)條件下,分別取搖瓶時(shí)間為2d、4d、5d、7d的培養(yǎng)液,離心后,取上清液,經(jīng)濾膜孔徑為0.22μm細(xì)菌過濾器過濾除菌后,測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間的培養(yǎng)原液對(duì)茶褐斑病菌的抑菌活性。1.2.6數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析2結(jié)果與分析2.1不同菌種間的濃度對(duì)csn-18、csn-3的協(xié)同培養(yǎng)效果影響在PDA培養(yǎng)基上,CSN-18與CSN-3的菌絲體互相交織,相互混合生長(zhǎng),相容性良好(圖1);在液體培養(yǎng)條件下,與兩菌分別單獨(dú)培養(yǎng)相比,CSN-18與CSN-3的混合培養(yǎng)在培養(yǎng)2d后,培養(yǎng)液顏色轉(zhuǎn)為淡黃色;隨后,菌絲球體積減小,培養(yǎng)液顏色變深,由淡黃色變?yōu)辄S褐色,培養(yǎng)液逐漸粘稠,并散發(fā)出一股清香的氣味(圖2)。Mellefontetal.(2008)研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)不同的菌種之間的濃度相當(dāng)時(shí),混合培養(yǎng)的協(xié)同增長(zhǎng)作用最為顯著。因此,根據(jù)對(duì)峙培養(yǎng)的結(jié)果,后續(xù)試驗(yàn)確定CSN-18和CSN-3以1:1的接種量接入液體培養(yǎng)基中。2.2茶樹病原菌的生長(zhǎng)抑制率兩菌混合培養(yǎng)原液的乙酸乙脂萃取液對(duì)不同供試植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用有顯著差異(p<0.05),且全部顯著高于兩菌單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)相應(yīng)供試植物病原真菌的抑制作用(表1)。兩菌混合培養(yǎng)液的乙酸乙脂萃取液對(duì)茶花褐斑病菌和稻瘟病菌的抑制作用最強(qiáng),抑制率分別高達(dá)79.48%±1.46%和76.99%±0.91%,對(duì)其他茶樹病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率也在59.76%±0.71%-71.51%±4.93%之間,對(duì)黃瓜枯萎病菌、三七根腐病病菌和白菜炭疽病菌的抑制效果在17.79%±3.85%-51.67%±1.67%之間。兩菌混合培養(yǎng)原液的乙酸乙脂萃取液對(duì)不同供試植物病原真菌孢子萌發(fā)的抑制作用有顯著差異(p<0.05),且全部顯著高于兩菌單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)相應(yīng)供試植物病原真菌的抑制作用(表2)。兩菌混合培養(yǎng)原液的乙酸乙脂萃取液對(duì)茶花褐斑病菌孢子萌發(fā)的抑制率高達(dá)100%,;對(duì)茶云紋葉枯病菌、茶輪斑病菌和茶炭疽病菌的抑制率也分別達(dá)到90.90%±2.59%、76.67%±3.06%和71.00%±4.00%;對(duì)黃瓜枯萎病菌和三七根腐病菌的抑制率較低,分別為32.00%±7.00%和34.67%±7.37%。2.3混合培養(yǎng)溶液對(duì)茶棕櫚樹的抑制作用2.3.1合培養(yǎng)液對(duì)油茶褐斑病菌菌落直徑的影響由于兩菌混合培養(yǎng)原液的乙酸乙脂萃取液對(duì)供試植物病原真菌中的茶花褐斑病菌的抑制作用最為明顯,因此,選用茶花褐斑病菌為敏感菌,進(jìn)一步研究了兩菌混合培養(yǎng)原液的抑菌作用。培養(yǎng)96h后,混合培養(yǎng)液的處理中,茶花褐斑病菌的菌落直徑平均只有2.81cm(圖3),與對(duì)照組的6.15cm相比,對(duì)茶花褐斑病菌的抑制率為54.30%±2.31%。在曲霉CSN-3單獨(dú)培養(yǎng)的培養(yǎng)原液處理中,茶花褐斑病菌的直徑為4.68±0.29cm,與對(duì)照組6.15±0.32cm相比,對(duì)茶花褐斑病菌的抑制率僅為26.1%±4.79%;而在含有長(zhǎng)枝木霉CSN-18單獨(dú)培養(yǎng)的培養(yǎng)原液的處理中,茶花褐斑病菌的菌落直徑高達(dá)6.47±0.16cm,促進(jìn)了茶花褐斑病菌的生長(zhǎng)。與單獨(dú)培養(yǎng)相比,混合培養(yǎng)的培養(yǎng)原液對(duì)茶花褐斑病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用有極顯著性差異。2.3.2不同度的懸液中芽孢萌發(fā)率茶花褐斑病菌孢子在清水中的萌發(fā)率為21.05%±0.52%,在含混合培養(yǎng)液原液濃度為10%、20%和30%的懸液中,孢子萌發(fā)率分別為21.24%±0.89%、42.28%±0.68%和40.98%±1.24%;懸液中混合培養(yǎng)原液濃度為40%-100%時(shí),孢子萌發(fā)率全部為0,表明茶花褐斑病菌的孢子萌發(fā)完全被抑制(圖4)。2.3.3培養(yǎng)時(shí)間對(duì)油茶褐斑病菌生長(zhǎng)的影響混合培養(yǎng)2d時(shí),培養(yǎng)液對(duì)茶花褐斑病菌菌絲的生長(zhǎng)沒有影響;隨著搖瓶培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng),抑制作用逐漸增強(qiáng)(圖5)?；旌吓囵B(yǎng)時(shí)間為5d時(shí),培養(yǎng)原液對(duì)茶花褐斑病菌菌絲生長(zhǎng)的相對(duì)抑制率達(dá)70.60%±3.33%。而培養(yǎng)7d時(shí),培養(yǎng)液的相對(duì)抑制率下降到44.70%±0.67%。方差分析結(jié)果顯示:不同培養(yǎng)時(shí)間的培養(yǎng)液對(duì)茶花褐斑病菌的抑制率有極顯著性差異(df=3,F=1114.750,p<0.01)。說明培養(yǎng)時(shí)間為5d時(shí),培養(yǎng)液對(duì)茶花褐斑病菌的抑制效果較好。3混合培養(yǎng)對(duì)內(nèi)生真菌作用的影響將代謝類型不同的微生物進(jìn)行混合培養(yǎng)已經(jīng)應(yīng)用于尋找新型代謝產(chǎn)物,以進(jìn)行藥物研發(fā)。Cuetoetal.(2001)發(fā)現(xiàn)從海藻中分離到的海洋真菌和1株有抗藥性的海洋細(xì)菌混合發(fā)酵時(shí)可以產(chǎn)生各菌單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)所不能產(chǎn)生的新型抗生素Pestalone,該物質(zhì)能明顯抑制耐甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素的屎腸球菌。Ohetal.(2005)將1株海洋真菌Libertellasp.和1株海洋細(xì)菌混合發(fā)酵培養(yǎng),產(chǎn)生了單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)不能產(chǎn)生的4種代謝產(chǎn)物libertellenonesA-D,這4種代謝產(chǎn)物對(duì)人肺腺癌細(xì)胞HCT-116具有細(xì)胞毒活性作用。田黎等(2005)、黃兵等(2009)的研究也得出相似的結(jié)果。在內(nèi)生真菌的研究中,朱峰和林永成(2006)將混合發(fā)酵技術(shù)運(yùn)用于兩株南海紅樹內(nèi)生真菌的培養(yǎng),產(chǎn)生了新的1-異喹啉酮類生物堿Marinamide和其甲酯,該類物質(zhì)是單獨(dú)發(fā)酵所不能產(chǎn)生的;Strobeletal.(2008)采用內(nèi)生真菌混合培養(yǎng),或內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物混合配制,也產(chǎn)生了更強(qiáng)的抑菌效果。本研究中,在單獨(dú)培養(yǎng)條件下,茶樹內(nèi)生真菌長(zhǎng)枝木霉CSN-18和茶樹內(nèi)生真菌曲霉CSN-3的培養(yǎng)液對(duì)茶花褐斑病菌不表現(xiàn)抑制真菌作用或抑制作用較弱(圖3),混合培養(yǎng)后,抑制作用顯著提高;同時(shí),兩菌混合培養(yǎng)原液的乙酸乙脂萃取液對(duì)不同供試植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制作用顯著高于兩菌單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)相應(yīng)供試植物病原真菌的抑制作用(表1),培養(yǎng)特性也發(fā)生改變(圖2),表明混合培養(yǎng)條件下很可能產(chǎn)生了單獨(dú)培養(yǎng)條件下所沒