腫瘤標(biāo)志物在腫瘤病理特征中的表達(dá)

腫瘤標(biāo)志物在腫瘤病理特征中的表達(dá)

腫瘤分子特征在腫瘤診斷、入侵和轉(zhuǎn)移、療效評估和預(yù)后預(yù)測方面發(fā)揮著重要作用。人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)了大量腫瘤相關(guān)新基因,闡明新基因在腫瘤臨床診斷和預(yù)后預(yù)測中的作用,篩選新的腫瘤早期診斷和預(yù)后預(yù)測的分子標(biāo)志物,迫切需要新技術(shù)能大規(guī)模和高通量地研究這些新基因在成百上千例腫瘤的不同發(fā)展階段、不同分化程度和其相應(yīng)正常組織中的表達(dá)。而組織芯片技術(shù)為從成千上萬的侯選基因中篩選到與某一疾病類型特異相關(guān)的分子標(biāo)志物提供了新的高通量工具。組織芯片是繼基因芯片和蛋白芯片之后生物芯片家族的又一新成員,能夠有效利用成百上千份正常或處于疾病狀態(tài)下的組織標(biāo)本分別在基因、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上進(jìn)行研究。本文對組織芯片技術(shù)在篩選腫瘤分子標(biāo)志物中的應(yīng)用現(xiàn)狀和進(jìn)展做一簡要綜述。1組織芯片技術(shù)的概論1.1組織芯片co-微陣列組織芯片的基本概念來源于1986年Battifora對制作具有多腫瘤組織蠟塊的方法進(jìn)行了全新改進(jìn),通俗稱之為香腸蠟塊(“sausageblock”),該方法是不規(guī)則地放置大量腫瘤組織標(biāo)本于受體蠟塊中。1998年Kononen等首次對組織芯片技術(shù)進(jìn)行了定義。組織芯片(tissue-chip)又稱組織微陣列(tissuemicroarray,TMA),是從許多供體蠟塊中鑿出的圓形供體組織以微陣列方式重新排列在受體蠟塊上,一個(gè)受體蠟塊?？扇菁{400~1000個(gè)直徑為0.6~2.0mm的供體組織。組織微陣列可用于各種原位表達(dá)研究。1.2本研究標(biāo)本一般按照樣本數(shù)目的多少,將組織芯片分為低密度組織芯片(200點(diǎn))、中密度組織芯片(200~600點(diǎn))和高密度組織芯片(>600點(diǎn))。組織芯片一般含有50~800例標(biāo)本。根據(jù)研究目的不同,組織芯片可以分為腫瘤組織芯片、正常組織芯片、單一或復(fù)合型組織芯片,以及特定病理類型組織芯片等。腫瘤組織的組織芯片又可分為多腫瘤組織芯片、腫瘤進(jìn)展和預(yù)后組織芯片。多腫瘤組織芯片由不同組織類型的各種腫瘤標(biāo)本組成,用于檢測在不同腫瘤類型組織中目的基因的表達(dá)改變。腫瘤進(jìn)展組織芯片用于研究在某一特定腫瘤不同病變階段中目的基因的表達(dá)改變;預(yù)后組織芯片是包括患者臨床隨訪以及臨床終結(jié)資料的組織芯片。1.3組織芯片的研究一個(gè)普遍關(guān)心的問題是在組織芯片中小供體組織用于基因原位表達(dá)分析是否能替代常規(guī)的腫瘤組織標(biāo)本提供有意義的研究結(jié)果。已有多個(gè)研究中心對常規(guī)的組織切片與組織芯片切片進(jìn)行對比研究,并對同一組織中鑿取1條供體組織與10條供體組織進(jìn)行對比研究。研究證實(shí)0.6mm大小的供體組織可以代替常規(guī)組織切片,其結(jié)果的一致率達(dá)95%(2個(gè)供體組織)和99.5%(5個(gè)供體組織)以上。另有研究表明,常規(guī)福爾馬林固定、石蠟包埋的存檔組織標(biāo)本用于構(gòu)建組織芯片、用于基因原位表達(dá)的研究是非常有效的。對于高度異質(zhì)性的腫瘤組織標(biāo)本,0.6mm大小的組織標(biāo)本并不能完全獲得所有源于常規(guī)大標(biāo)本中的信息,組織芯片的研究結(jié)果與常規(guī)腫瘤組織切片的結(jié)果存在一些差異。盡管如此,有臨床應(yīng)用價(jià)值的一些分子標(biāo)志物在腫瘤組織中的表達(dá)常是相對均一性,因此,組織芯片是適宜于檢測這些重要的已知或具有潛臨床意義的分子靶點(diǎn)。為了增加組織標(biāo)本的代表性,從同一腫瘤患者的石蠟包埋的不同組織標(biāo)本或轉(zhuǎn)移部位的組織標(biāo)本中鑿取供體組織制作的組織芯片的有效性往往超過常規(guī)腫瘤組織切片。1.4rt-pcr和原位微織構(gòu)各組的互聯(lián)互通組織芯片不但克服了傳統(tǒng)病理學(xué)方法和DNA芯片技術(shù)中存在的某些缺陷,而且可與傳統(tǒng)的病理技術(shù)、組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、原位雜交、原位PCR、原位RT-PCR和原位DNA合成等技術(shù)相結(jié)合,提供大規(guī)模、高通量、快速地在原位組織中對基因的DNA擴(kuò)增、mRNA的表達(dá)豐度和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。組織芯片高通量、多樣本、經(jīng)濟(jì)省時(shí)、降低誤差、便于設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對照、可與其它生物技術(shù)相結(jié)合、用途廣泛等優(yōu)點(diǎn)是其日益受寵的原因。盡管組織芯片制作儀價(jià)格昂貴,組織芯片技術(shù)本身也存在一些缺陷,但一些新型簡潔的組織芯片制作儀器和相關(guān)技術(shù)的發(fā)明,極大地降低了制作成本并促進(jìn)了組織技術(shù)的推廣應(yīng)用。2聯(lián)合基因芯片和藥物組織芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于人類腫瘤的研究中,組織芯片技術(shù)在研究腫瘤相關(guān)基因的生物學(xué)功能及篩選腫瘤相關(guān)標(biāo)志物等方面發(fā)揮了重要作用,與基因芯片聯(lián)合可用于新的腫瘤候選基因的篩選;與FISH和ISH等聯(lián)合可用于基因水平的腫瘤標(biāo)志物的篩選;與免疫組化聯(lián)合可用于蛋白水平的腫瘤標(biāo)志物的篩選。目前,組織芯片技術(shù)已用于肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、肝癌、胃癌和腎癌等多種常見惡性腫瘤的相關(guān)分子標(biāo)志物的研究,并獲得一些具有臨床重要應(yīng)用價(jià)值的分子標(biāo)志物。2.1her-2/neu與nsclc的臨床信息背景,主要有基因芯片和菌株Tan等利用高密度TMA、免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)和熒光標(biāo)記的原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)技術(shù)在同一實(shí)驗(yàn)條件下檢測了表皮生長因子家族的第2位成員HER-2/neu(也稱C-erbB-2)在140例非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)中的表達(dá),檢測有效率達(dá)到了94%,且與傳統(tǒng)的整個(gè)病理組織切片方法相比較,實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差無幾。研究結(jié)果顯示HER-2/neu蛋白的過表達(dá)與HER-2/neu基因擴(kuò)增顯著相關(guān),且HER-2/neu基因擴(kuò)增及其蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)的患者具有較短的生存期,低分化和高分化腫瘤組織中HER-2/neu表達(dá)和基因擴(kuò)增率的不同,表明HER-2/neu與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān)。Sugita等結(jié)合TMA和基因芯片技術(shù)快速篩選和鑒別了與臨床相關(guān)的肺癌生物學(xué)標(biāo)記,首先用基因芯片檢測了兩種NSCLC細(xì)胞系(A549,H647)和兩種小細(xì)胞肺癌(smallcelllungcancer,SCLC)細(xì)胞系(SHP-77,UMC-19)的基因表達(dá)譜,然后在含187個(gè)NSCLC組織標(biāo)本的芯片上進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果顯示在20種異常高表達(dá)的基因中有6種屬于癌/睪丸抗原(cancer/testisantigen,CTAG)基因家族,包括NY-ESO-1和5種MAGE-A亞家族基因,它們在SCLC細(xì)胞系中均高表達(dá),而在NSCLC細(xì)胞系中NY-ESO-1不表達(dá),MAGE-A低表達(dá);另經(jīng)免疫組化證實(shí),44%的早期NSCLC細(xì)胞胞漿和/或核中表達(dá)MAGE-A,認(rèn)為MAGE-A基因表達(dá)與NSCLC(尤其是鱗狀細(xì)胞癌)的組織學(xué)分型有關(guān),CTAG基因及產(chǎn)物的表達(dá)對早期鱗狀癌和小細(xì)胞癌的檢測和病情監(jiān)測有重要作用?？梢娀蛐酒cTMA配合使用能夠快速地篩選腫瘤相關(guān)基因并評估其生物學(xué)意義,有助于建立與診斷、治療和預(yù)后有關(guān)的指標(biāo),構(gòu)成完整的基因檢測體系。Tan等利用TMA與免疫組化研究了甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1(TTF-1)在NSCLCs中的表達(dá)及臨床意義,結(jié)果顯示TTF-1在肺腺癌中顯著表達(dá),有可能作為NSCLCs的一種預(yù)后因素。Deeb等利用Beecher組織微陣列儀從130例肺癌組織(Ι~ША期)石蠟標(biāo)本中每例鑿取2~3個(gè)組織柱制備了組織微陣列,研究發(fā)現(xiàn)E-cad和EGFR的表達(dá)情況可作為肺腺癌和肺鱗癌臨床分期的根據(jù),E-cad陰性和E-cad在細(xì)胞質(zhì)中的異位表達(dá)與低生存率顯著相關(guān),EGFR的表達(dá)與生存率無關(guān)。2.2肺癌腫瘤相關(guān)基因表達(dá)抑癌基因表達(dá)下調(diào)或缺失與多種惡性腫瘤密切相關(guān)。Lo等利用RT-PCR和組織芯片免疫組化染色法研究Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族基因1A(Rasassociationdomainfamilygene1A,RASSF1A)在鼻咽癌發(fā)病中的作用,發(fā)現(xiàn)鼻咽癌中RASSF1A在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)方面均下調(diào),并與WHO腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等顯著相關(guān),表明RASSF1A可能作為鼻咽癌的分子標(biāo)志。87%鼻咽癌臨床標(biāo)本中存在TSLC1基因表達(dá)下調(diào)或缺失。Lung等應(yīng)用組織芯片和免疫組化法檢測肺癌腫瘤抑制物1(tumorsuppressorinlungcancer1,TSLC1)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)與原發(fā)鼻咽癌比較,TSLC1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌中表達(dá)顯著下調(diào)或缺失,提示TSLC1很可能是鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤抑制基因。p63是新近被證實(shí)的p53家族的成員之一,Guo等構(gòu)建了包含202例鼻咽癌、29例鼻咽部炎癥病例以及17例正常鼻咽上皮的組織芯片,結(jié)合免疫組化法研究p63與鼻咽癌的關(guān)系,結(jié)果顯示p63在鼻咽癌中高表達(dá)(100%,202/202),而在鼻咽部炎癥和正常鼻咽上皮中不表達(dá),p63可作為鼻咽癌診斷的輔助分子標(biāo)志。Fan等制作了由148例鼻咽癌和164例具有不同病理形態(tài)學(xué)特征的非癌性鼻咽上皮組成的含390個(gè)組織點(diǎn)陣的鼻咽癌組織芯片,研究EB病毒編碼的小RNA-1(EBER-1)和一些腫瘤相關(guān)基因在組織芯片中的表達(dá),結(jié)果表明EB病毒感染、p53過表達(dá)以及p16和p27蛋白的表達(dá)缺失在鼻咽上皮癌變中起重要作用。KIAA1173基因位于染色體3p22.1區(qū),是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)基因,Zhang等采用組織芯片和原位雜交法證實(shí)KIAA1173基因高表達(dá)于正常鼻咽黏膜而在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào),認(rèn)為KIAA1173很可能是與鼻咽癌癌變相關(guān)的新基因。2.3slp-2細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)Barlund等將比較基因組雜交(CGH)、cDNA芯片和組織芯片技術(shù)相結(jié)合研究乳腺癌基因擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)17q23上至少有2個(gè)獨(dú)立區(qū)域(S6K和HER-2)呈現(xiàn)高水平擴(kuò)增;同時(shí)用668例原發(fā)性乳腺癌組織芯片進(jìn)一步證實(shí)了在細(xì)胞系中的過表達(dá)和擴(kuò)增基因的存在,且其擴(kuò)增與預(yù)后差有關(guān);S6K與HER-2同時(shí)擴(kuò)增與生存期短相關(guān)。細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白-1(caveolin-1)在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用,研究表明細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白-1與多種癌癥發(fā)生發(fā)展的特定階段密切相關(guān)。Liedtke等研究了正常、良性及惡性乳腺組織標(biāo)本中細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白-1的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白-1與乳腺癌的浸潤顯著相關(guān)。已經(jīng)證實(shí)SLP-2是一新的腫瘤相關(guān)基因,其蛋白在多種癌癥中呈現(xiàn)高水平表達(dá)。Cao等應(yīng)用乳腺癌組織芯片研究發(fā)現(xiàn)SLP-2高表達(dá)患者的生存率低,腫瘤體積較大,其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率也較SLP-2低表達(dá)者高。2.4波形蛋白的基因組化和病理組織學(xué)檢測Richter等用FISH分析cyclinE基因在膀胱癌組織中的擴(kuò)增情況,發(fā)現(xiàn)其擴(kuò)增與膀胱癌分級、分期和預(yù)后顯著相關(guān)。Moch等應(yīng)用兩種芯片技術(shù)研究腎癌細(xì)胞系CRL-1933的基因表達(dá)狀況。第一步先采用含5148個(gè)cDNA克隆的DNA芯片研究腎癌細(xì)胞系與正常腎組織之間基因表達(dá)的差異,篩選出89個(gè)差異表達(dá)的基因,發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)編碼波形蛋白的基因差異最為顯著;第二步用波形蛋白單抗作為探針,免疫組化方法檢測由532個(gè)腎癌樣本構(gòu)成的組織芯片,發(fā)現(xiàn)波形蛋白常見于透明細(xì)胞癌和乳頭狀細(xì)胞癌,少見于嫌色細(xì)胞癌和大嗜酸性細(xì)胞癌,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)波形蛋白與腎癌的預(yù)后不良相關(guān),而與疾病分期和病理分化無關(guān)。Chen等利用組織芯片檢測頭頸癌中低氧調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核因子κB(NF-κB)抑制物IκB激酶β是一種新型內(nèi)源性腫瘤低氧性標(biāo)記物,可能代表一種抗癌治療的新靶標(biāo)。2.5波形蛋白在肝臟肺癌轉(zhuǎn)移中的表達(dá)Lugli等利用組織芯片分析肝細(xì)胞石蠟1(hepatocyteparaffin-1,HepParl)在正常肝臟組織和腫瘤組織中的表達(dá),認(rèn)為HepParl是鑒別原發(fā)性和繼發(fā)性肝癌的標(biāo)志。Hu等利用組織芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)波形蛋白(vimentin)的過表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān),表明波形蛋白過表達(dá)在肝細(xì)胞肝癌轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。Lee等應(yīng)用TMA免疫組化方法分析線粒體絲氨酸蛋白激酶Omi/HtrA在60例晚期胃腺癌中的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性表達(dá)為43例(72%),而正常胃黏膜的黏液細(xì)胞和黏液頸細(xì)胞無表達(dá)或表達(dá)很弱,提示體內(nèi)胃癌細(xì)胞凋亡需要有Omi/HtrA的表達(dá)。2.6埃茲蛋白和腦膠質(zhì)瘤Tynnineu等應(yīng)用組織芯片技術(shù)檢測細(xì)胞骨架聯(lián)接蛋白埃茲蛋白(ezrin)在299例原發(fā)性和復(fù)發(fā)性星形細(xì)胞瘤,以及113例少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突星形細(xì)胞瘤(均為WHOII~III級)中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞埃茲蛋白染色的強(qiáng)度和數(shù)量與星形細(xì)胞瘤和少突星形細(xì)胞瘤的惡性程度增高有關(guān),在星形細(xì)胞瘤中表達(dá)最強(qiáng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),原發(fā)性膠質(zhì)瘤中,埃茲蛋白的高表達(dá)與復(fù)發(fā)、預(yù)后差有關(guān),并且在腫瘤進(jìn)展期間也高表達(dá)。研究結(jié)果表明,埃茲蛋白表達(dá)與膠質(zhì)瘤進(jìn)展相關(guān)、組織學(xué)細(xì)胞類型和WHO腫瘤級別有關(guān)。此外,Schraml等構(gòu)建17種惡性腫瘤的組織芯片,含397個(gè)腫瘤組織樣本,用原位雜交分析發(fā)現(xiàn),乳腺癌、肺癌、頭頸部及膀胱來源腫瘤和黑色素瘤中有細(xì)胞周期素cyclinD1(CCND1)表達(dá);在膀胱、乳腺、結(jié)腸、胃、睪丸和肺癌中有ERBB-2表達(dá),ERBB-2是原癌基因ERBB-2編