薏苡仁油融合指紋圖譜研究

薏苡仁油融合指紋圖譜研究

愛斯隆特的種子有點(diǎn)冷，味道溫和而輕。具有補(bǔ)水消腫、健脾除濕、清熱祛膿的功效。這是水稻科的一種干燥和成熟的種子。近年研究發(fā)現(xiàn)薏苡仁油主要的活性成分甘油三酯類具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用,其中以油酸和亞油酸的量居高,還含有抗癌活性很強(qiáng)的奇數(shù)碳鏈脂肪酸。國內(nèi)對薏苡仁的開發(fā)利用極為重視,目前對薏苡仁油GC和HPLC指紋圖譜研究的文獻(xiàn)較少。本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射(HPLC-ELSD)測定方法,建立薏苡仁油融合指紋圖譜,從而對薏苡仁油物質(zhì)基礎(chǔ)信息有更清晰完整的認(rèn)識,為建立薏苡仁油的質(zhì)量控制方法提供依據(jù),從方法學(xué)上為中藥質(zhì)量控制研究提供參考。1主要試劑與儀器Agilent1200型高效液相色譜儀、6980N—5975B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Agilent公司;AlltechELSD2000型蒸發(fā)光散射檢測器,美國奧泰公司;AG—40型無油空氣壓縮機(jī),山東省化工研究所;MettlerAE240電子天平,瑞士梅特勒公司;KQ—250E型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;HC—100型高速多功能粉碎機(jī),浙江金山機(jī)械制造公司。薏苡仁藥材購自不同產(chǎn)地:廣西,批號20130205(S1)、20130819(S2);貴州,批號20130201(S3)、20130901(S4);山東,批號20130101(S5)、20130805(S6);經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)周鳳琴教授鑒定,為禾本科薏苡屬植物薏苡Coixlachryma-jobiL.var.mayuen(Roman.)Stapf的干燥成熟種仁。甘油三油酸酯對照品(批號111692-201303)購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、二氯甲烷均為色譜純,丙酮、甲醇、濃硫酸、醋酸乙酯均為分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。2方法2.1樣品的制備2.1.1杏仁油的制備薏苡仁藥材50g粉碎過60目篩,精密稱定,丙酮回流提取2h,重復(fù)提取3次,濾過,合并濃縮得薏苡仁油。2.1.2gc-ms萃取取薏苡仁油適量,按10mL/g加入濃硫酸-甲醇(2∶98)混合液,70℃回流1h,冷卻,10mL醋酸乙酯萃取,萃取液無水Na2SO4干燥,以0.45μm微孔濾膜濾過,作為GC-MS供試品溶液。2.1.3hplc-elsd樣品的制備精密稱取20mg薏苡仁油,以乙腈-二氯甲烷(65∶35)定容,0.45μm微孔濾膜濾過,作為HPLC-ELSD供試品溶液。2.1.4對照品溶液的制備取甘油三油酸酯對照品適量,精密稱定,加流動(dòng)相制成含甘油三油酸酯0.14mg/mL的溶液,0.45μm微孔濾膜濾過,作為對照品溶液。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及儀器色譜柱為HP-5MS(30m×250μm,0.25μm),美國Agilent公司;載氣為氦氣,體積流量為1.0mL/min;前進(jìn)樣口溫度250℃,接口溫度280℃;初始溫度180℃,保持20min,平衡時(shí)間為1min,以5℃/min程序升溫至230℃保持5min;進(jìn)樣量0.2μL;分流比10∶1。質(zhì)譜條件:標(biāo)準(zhǔn)譜圖調(diào)諧;電離方式EI,電子能量70eV;離子源溫度:230℃;四級桿溫度:150℃;數(shù)據(jù)采集掃描模式:全掃描;質(zhì)量范圍m/z:50~550。2.3蒸發(fā)光散射分離器aglent公司色譜柱為EclipseXDB-C18(150mm×4.6mm,5μm),美國Agilent公司;流動(dòng)相為乙腈-二氯甲烷(65∶35);柱溫25℃;體積流量1mL/min;進(jìn)樣量30μL。蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù):漂移管溫度為70℃;載氣體積流量為2L/min。2.4經(jīng)峰面積歸一化按照“2.2”、“2.3”項(xiàng)下條件分別測定不同薏苡仁油樣品,對所得色譜數(shù)據(jù)經(jīng)峰面積歸一化處理,導(dǎo)出為txt文檔。樣品的GC部分和HPLC部分的數(shù)據(jù)經(jīng)MicrosoftOfficeExcel2003軟件融合,融合數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”,得到薏苡仁油融合指紋圖譜。2.5方法研究2.5.1方法的精密度試驗(yàn)取貴州產(chǎn)地同一批次藥材,參照“2.1”~“2.4”項(xiàng)下方法制備樣品、分析、融合,平行6次,所得融合指紋圖譜各共有峰的相對保留時(shí)間RSD均低于1.0%,相對峰面積RSD低于5.0%,說明方法的精密度良好。2.5.2方法的重復(fù)性精密稱取貴州產(chǎn)地同一批次薏苡仁生藥6份,參照“2.1”~“2.4”項(xiàng)下方法制備樣品、分析、融合,計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間RSD均低于1.0%,相對峰面積RSD基本低于5.0%,說明方法重復(fù)性良好。2.5.3方法融合性驗(yàn)證取貴州產(chǎn)地同一批次藥材,分別制備樣品,按照“2.2”、“2.3”項(xiàng)下方法分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣,所得數(shù)據(jù)按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行融合處理,計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間的RSD均低于3.0%,相對峰面積RSD均低于5%,表明該方法處理的供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。3結(jié)果與分析3.1gc-ms總離子流圖按照“2.1.2”項(xiàng)下條件制備供試液,按照“2.2”項(xiàng)下的條件進(jìn)行GC-MS分析,所得薏苡仁油甲酯化GC-MS總離子流圖見圖1。圖1中13個(gè)共有峰代表的脂肪酸類成分經(jīng)NIST2008數(shù)據(jù)庫檢索并結(jié)合質(zhì)譜鑒定,主要化合物包括:棕櫚酸甲酯、(Z,Z)-9,12-亞油酸甲酯、8-十八烯酸甲酯、硬脂酸乙酯、十八烯酸乙酯、順-11-二十烯酸甲酯,見表1。3.2成品色譜結(jié)果融合指紋圖譜的HPLC-ELSD分析薏苡仁油的甘油三酯類組分檢測到8個(gè)峰,樣品與對照品三油酸甘油酯色譜圖見圖2。在相同色譜條件下,以對照品(S)為標(biāo)定,參照國家藥典委員會(huì)公布的康萊特注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、注射用薏苡仁油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[6及文獻(xiàn)報(bào)道色譜峰出峰順序,得到一致的薏苡仁油HPLC-ELSD色譜圖,推斷其中1~8號色譜峰依次為三亞油酸甘油酯、二亞油酸油酸甘油酯、棕櫚酸二亞油酸甘油酯、二油酸亞油酸甘油酯、棕櫚酸亞油酸油酸甘油酯、二棕櫚酸亞油酸甘油酯、三油酸甘油酯、棕櫚酸二油酸甘油酯。3.3指紋圖譜的建立及分析按照“2.4”項(xiàng)下方法數(shù)據(jù)歸一化后,按照前半部分是GC指紋圖譜的數(shù)據(jù),后半部分為HPLC指紋圖譜的數(shù)據(jù),經(jīng)基線校正,得到不同產(chǎn)地薏苡仁油融合指紋圖譜,融合圖譜中tR0~35min為GC-MS檢測圖譜,tR35min以后為HPLC-ELSD檢測圖譜,結(jié)果見圖3,合并“3.1”與“3.2”項(xiàng)下分析所得化合物結(jié)果,共指認(rèn)21個(gè)共有峰的結(jié)構(gòu),結(jié)果見表1。4融合指紋圖譜由于中藥藥材成分復(fù)雜,現(xiàn)行的各種單一測定方法給出信息少,單一色譜技術(shù)進(jìn)行所有藥材的指紋圖譜分析,整體性較差,模糊性較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)建立的GC-MS與HPLC-ELSD采集數(shù)據(jù)聯(lián)合表達(dá)的融合指紋圖譜