穿破石總黃酮對(duì)兩種肝纖維化模型大鼠的影響

穿破石總黃酮對(duì)兩種肝纖維化模型大鼠的影響

穿過(guò)巖石是屬于桑蠶科的哲類植物（cudraniacon）。udoetmasam或慈姑的cudroniaticussipam的根具有活血、祛瘀、止痛的功效。它也可以用來(lái)治療肝炎和黃黃疸。為探討穿破石抗肝纖維化的作用機(jī)理,現(xiàn)對(duì)穿破石總黃酮(totalflavonesofCudraniacochinchinensis,TFC)抗肝纖維化開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究。1材料表面1.1?？浦参飿?gòu)膠根穿破石,采自廣西龍虎山,挖出植物根部,除去須根,洗凈,切段曬干備用。經(jīng)本所生藥室梁定仁主任鑒定,為?？浦参飿?gòu)棘的根。豬血清,新鮮豬血購(gòu)自南寧肉聯(lián)廠,冷凍離心,取上清液層,經(jīng)過(guò)濾滅菌,備用。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠100只,雌雄各半,分籠飼養(yǎng),由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。1.3檢測(cè)試劑和檢測(cè)試劑丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(DMA)、超氧化物岐化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所,CCl4購(gòu)自南寧市醫(yī)藥總公司。1.4r低溫高速離心紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)貝克曼公司);64R低溫高速離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司);ZS83-1型內(nèi)切式組織勻漿機(jī)(浙西機(jī)械廠),半自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼公司)。2方法2.1黃酮含量的測(cè)定穿破石經(jīng)蒸餾水多次抽提,水提液過(guò)3250吸附樹(shù)脂層析柱,洗脫后,經(jīng)減壓濃縮,冷凍干燥得總黃酮部位,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn),利用分光光度計(jì)測(cè)定各組分的黃酮含量,黃酮含量組為42%。2.2療效實(shí)驗(yàn)2.2.1動(dòng)物組100只大鼠隨機(jī)分為10組,每組10只,其中50只用于化學(xué)損傷模型實(shí)驗(yàn),另外50只用于免疫模型實(shí)驗(yàn)。2.2.2模型造模和給藥分穿破石高、中、低三個(gè)劑量組、模型組和空白組。除空白組外,其余各組均按體重腹腔注射40%CCl4花生油溶液,每周2次,造模同時(shí)也開(kāi)始給藥,穿破石高、中、低三個(gè)劑量組每天按體重10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg總黃酮灌胃給藥1次,模型組和空白組按體重灌胃等量蒸餾水。2.2.3造模、給藥、造模和培養(yǎng)方法分穿破石高、中、低三個(gè)劑量組、模型組和空白組。除空白組外,其余各組均腹腔注射無(wú)菌豬血清(0.5ml/只/3天),造模同時(shí)也開(kāi)始給藥,穿破石高、中、低三個(gè)劑組每天按體重10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg總黃酮灌胃給藥1次,模型組和空白組按體重灌胃等量蒸餾水。2.2.4mda、sod檢測(cè)(1)8周后,麻醉大鼠,腹腔動(dòng)脈采血,分離血清,用賴氏法測(cè)ALT和AST。(2)取大鼠肝臟置冰生理鹽水洗凈血液,濾紙吸去水分后稱重,用PH7.4的PBS按1∶10稀釋冰浴下勻漿,4000r/min離心5min,取上清液,按試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)MDA、SOD含量。(3)取大鼠右小葉肝臟,剪取約0.5cm厚度肝組織,中性甲醛緩沖液固定,石蠟包埋,切片為5μm厚度。經(jīng)多級(jí)酒精脫水,二甲苯透明,作HE染色,天狼猩紅染色。2.3處理數(shù)據(jù)計(jì)數(shù)資料用t檢驗(yàn),等級(jí)分組資料用Riddit分析。3結(jié)果3.1造模前后alt和ast活性的變化在化學(xué)損傷模型中,模型組與空白組有顯著性差異(P<0.01),表明造模成功。而給藥組能顯著降低ALT活性,不同程度降低AST活性。而在免疫模型實(shí)驗(yàn)中,模型組與空白組并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,各給藥組對(duì)指標(biāo)影響并不明顯,結(jié)果見(jiàn)表1。3.2少mda含量的影響在化學(xué)損傷模型中,總黃酮可不同程度減少M(fèi)DA的含量,增加SOD活性。但在免疫模型中只在一定程度上增加SOD活性,對(duì)MDA的影響不大,結(jié)果見(jiàn)表2。3.3tfc對(duì)大鼠肝組織切片的影響光鏡下觀察,纖維組織增生情況以“++++”為最嚴(yán)重,“-”為無(wú)纖維增生。正常組大鼠肝組織切片顯示無(wú)肝纖維化形成,模型組纖維增生明顯,說(shuō)明兩種模型已造模成功,TFC各組對(duì)化學(xué)損傷模型均有不同程度改善,但對(duì)免疫模型的影響并不大。其中對(duì)化學(xué)損傷模型中的TFC高劑組可明顯降低大鼠纖維增生(P<0.01)。各組的Riddit分析的R值見(jiàn)表3。4兩種模型的對(duì)比CCl4所致肝纖維化模型屬化學(xué)損傷類型的肝纖維化模型。主要是由于CCl4在肝臟中經(jīng)肝微粒體細(xì)胞色素P450代謝,生成可攻擊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上磷脂分子的三氯甲基自由基,從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脂質(zhì)過(guò)氧化,進(jìn)而引起膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞,同時(shí)由于CCl4抑制細(xì)胞膜和微粒體膜鈣泵的活性,鈣內(nèi)流增加,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而豬血所誘導(dǎo)的免疫型肝纖維化模型,主要是由于血清引起機(jī)體產(chǎn)生可溶性免疫復(fù)合物,激活補(bǔ)體,并與肝細(xì)胞表面Fc受體結(jié)合而沉積于細(xì)胞膜,導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生免疫調(diào)節(jié)功能紊亂。血清ALT、AST指標(biāo)反映肝損傷的程度,而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要降解產(chǎn)物,即可顯示肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化水平,又能反過(guò)來(lái)?yè)p傷肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),導(dǎo)致肝細(xì)胞進(jìn)一步損傷。作為正面影響,SOD能催化自由基進(jìn)行歧化反應(yīng),使自由基不能與膜脂質(zhì)和蛋白發(fā)生二次反應(yīng),阻止自由基破壞肝細(xì)胞。通過(guò)對(duì)比兩種模型的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),在兩種模型均已成模的情況下,穿破石總黃酮對(duì)于化學(xué)損傷型肝纖維化大鼠有保護(hù)作用,而對(duì)免疫型肝纖維化程度的影