乳酸菌as18發(fā)酵特性研究

乳酸菌as18發(fā)酵特性研究

0乳酸菌的篩選蘑菇已經(jīng)在食品和食物中很古老。它可以降低食品的ph值，產(chǎn)生細(xì)菌代謝物質(zhì)。例如，gartenson陽性菌對革蘭氏陽性菌有很好的抑制作用。近幾年,國外許多研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌對霉菌和酵母也有一定的抑菌功能,篩選出具有良好抑真菌性能的乳酸菌,并將其應(yīng)用到食品中,有重要的實(shí)際應(yīng)用價值。本研究從中國傳統(tǒng)發(fā)酵制品中分離出的乳酸菌中篩選出一株具有較好抑真菌作用的菌株AST18,經(jīng)16srDNA鑒定為干酪乳桿菌。并對該菌抗菌物質(zhì)生成的發(fā)酵特性進(jìn)行了研究,為抗真菌乳酸菌發(fā)酵劑研究開發(fā)提供基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1momorsp.、啤酒酵母及酵母菌種本研究中,所用乳酸菌菌株分離自東北泡菜及酸奶,指示菌Penicilliumsp.、momursp.、兩株腐敗酵母均分離自霉變干酪,啤酒酵母YS-1,YS-2,YS-3,YS-4YS-5,YS-6,YS-7為本實(shí)驗(yàn)室提供,以上菌種均保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品微生物實(shí)驗(yàn)室。培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基。1.1.2培養(yǎng)液的制備按2%的接種量,將活化后的乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48h,經(jīng)離心(4000g,10min)收集上清液。將上清液用0.22μm無菌濾膜過濾。1.1.3培養(yǎng)情緒培養(yǎng)將Penicilliumsp.于PDA斜面培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)7d,直至孢子生成。用含有體積分?jǐn)?shù)為0.05%吐溫-80的無菌水沖洗斜面,用無菌紗布過濾,并利用血球計(jì)數(shù)板將孢子濃度調(diào)制為106mL-1。1.2方法1.2.1菌種的制備將20mLPDA培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿中,待凝固后將100L制備好的霉菌孢子懸浮液涂布于培養(yǎng)基上,將牛津杯(直徑8mm)輕置于平板上,靜置5min后取200L無菌體發(fā)酵液注入牛津杯中。30℃培養(yǎng)2d,測定抑菌圈直徑。1.2.2基因組dna提取、pcr擴(kuò)增及測序單菌落培養(yǎng):將脫脂乳保存的菌種接于MRS肉湯培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)18h,在MRS瓊脂平板中劃線培養(yǎng),使其長出單菌落。變性:在MRS瓊脂平板上挑取細(xì)菌于10μL滅菌水中變性后離心取上清作為模板。反應(yīng)條件為99℃(10min)。PCR擴(kuò)增:采用北京天根生化科技有限公司的TIANnampBacteria細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取AST18菌株基因組DNA,PCR擴(kuò)增引物為上海寶生物技術(shù)有限公司所提供,引物序列如下:使用TaKaRa16srDNABacterialIdentificationPCRKit(CodeNo.D310),進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)條件:94℃5.0min循環(huán)1次72℃5.0min循環(huán)1次PCR產(chǎn)物檢測及純化:預(yù)先制備1.0%的瓊脂糖凝膠,擴(kuò)增反應(yīng)完畢后,取5μL的PCR產(chǎn)物與1μL6×Loadingbuffer混合,加樣于瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中進(jìn)行電泳,電壓5V/cm。電泳后,用溴化乙錠染色20~30min,紫外燈下觀察。如果PCR成功,則可見到約為1500bp的條帶。采用寶生物公司的切膠回收試劑盒(TaKaRaCode:DV805A)純化回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。測序:以上述序列為引物進(jìn)行DNA測序。測序結(jié)果應(yīng)用于BLAST程序與美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的細(xì)菌16srDNA序列進(jìn)行相似性比較分析。1.2.3培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件對抑菌物質(zhì)生成的影響(1)培養(yǎng)基初始pH值對抑菌物質(zhì)生成的影響:用濃度為1mol/L的HCl和NaOH將MRS肉湯培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)至4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0。按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量接種,37℃培養(yǎng)48h后觀測抑菌圈大小、pH值及OD值。(2)培養(yǎng)溫度對抑菌物質(zhì)生成的影響:將初始pH值為6.5的MRS肉湯培養(yǎng)基按2%接種量分別在30,37及42℃培養(yǎng)48h后,觀測抑菌圈大小、pH值及OD值。(3)通氣條件對抑菌物質(zhì)生成的影響:用250mL錐形瓶37℃加不通氣丁基橡膠膠塞靜置培養(yǎng),棉塞靜置培養(yǎng),棉塞搖床培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速130r/min),48h觀測pH值、OD值及抑菌活性。(4)最佳發(fā)酵時間的選擇:將初始pH值為6.5的MRS肉湯培養(yǎng)基按2%接種量37℃恒溫靜置培養(yǎng),在0,6,8,12,24,36,48,60,72h測定抑菌圈大小、pH值及OD值。2結(jié)果分析2.1乳酸菌抑制活性60株乳酸菌中有7株對Penicilliumsp.和momursp.同時顯示出抑菌活性,Penicilliumsp.對乳酸菌發(fā)酵液相對momursp.敏感,定為試驗(yàn)指示菌。7株菌對從干酪中分得的腐敗酵母及啤酒酵母均無抑制作用。其中AST18顯示出最大抑菌活性,抑菌圈直徑達(dá)20.83mm。2.2pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的分離和測序PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測與序列鑒定:預(yù)先制備1.0%的瓊脂糖凝膠,擴(kuò)增反應(yīng)完畢后,取5μL的PCR產(chǎn)物與1μL6×Loadingbuffer混合,加樣于瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中進(jìn)行電泳,電壓5V/cm。電泳后,用溴化乙錠染色20~30min,紫外燈下觀察。見到約為1500bp的條帶。采用寶生物公司的切膠回收試劑盒(TaKaRaCode:DV805A)純化回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用上述的引物進(jìn)行DNA測序。用BLAST程序與美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的細(xì)菌16srDNA序列進(jìn)行相似性比較分析。結(jié)果:AST181-600核苷酸序列與美國國家菌種保藏中心標(biāo)準(zhǔn)菌株干酪乳桿菌LactobacilluscaseiATCC334同源性為99%。2.318其他材料的誕生性能2.3.1培養(yǎng)基初始ph值對ast18生長效果的影響用1mol/L的HCl和NaOH將MRS肉湯培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)至4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0。按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量接種,37℃培養(yǎng)48h后觀測抑菌圈大小、pH值及OD值。結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出,AST18在培養(yǎng)基初始pH值在6.0~6.5之間,生長狀況良好。且抑菌性能最佳。因此培養(yǎng)基初始pH值選為6.5。2.3.2抑菌圈大小及溫度對ast18生長的影響將初始pH值為6.5的MRS肉湯培養(yǎng)基按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量分別在30,37及42℃培養(yǎng)48h后,觀測抑菌圈大小、pH值及OD值,結(jié)果如表2所示。由表2可以看出,AST18抑菌物質(zhì)生成的最適溫度為37℃,當(dāng)溫度升高到42℃時,AST18生長及抑菌物質(zhì)的生成受到抑制。因此AST18最適生長溫度為37℃。2.3.3搖床條件下,菌體抗菌代謝產(chǎn)物的活性用250mL錐形瓶37℃加不通氣丁基橡膠膠塞靜置培養(yǎng),棉塞靜置培養(yǎng),棉塞搖床培養(yǎng)(100r/min),48h觀測pH值、OD值及抑菌活性,結(jié)果如表3所示。由表3可以看出,在搖床條件下,菌體抗菌代謝產(chǎn)物生成量較高,加不透氣丁基橡膠塞菌AST18生長受抑制。棉塞搖床培養(yǎng)同棉塞靜置培養(yǎng)的抑菌直徑及OD值差異不顯著。2.3.4抑菌圈測定法將初始pH值為6.5的MRS肉湯培養(yǎng)基按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量37℃恒溫靜置培養(yǎng),在0,6,8,12,24,36,48,60,72h測定抑菌圈大小、pH值及OD值,結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出,在發(fā)酵初期隨時間的增加,菌量和抑菌活性都在增加,但在48h時,抑菌活性達(dá)到最大值,后期發(fā)酵過程中隨時間變化不明顯,因此,最佳發(fā)酵時間選擇48h。3乳酸菌能促進(jìn)發(fā)酵霉菌和酵母幾乎在任何食品上都可以生長:谷物、水果、蔬菜、堅(jiān)果、乳制品等。O.Filtenborg等認(rèn)為與各食品霉變相關(guān)的霉菌只有少量幾種,大部分屬于青霉、曲霉和鐮刀霉。在酸奶和干酪等發(fā)酵乳制品中經(jīng)常造成污染的霉菌主要是Penicilliumcommune和Pnalgiovense。目前,生物防腐在延長食品貨架期和加強(qiáng)食品安全方面起到了越來越重要的作用。生物防腐主要是通過自然發(fā)酵、添加發(fā)酵劑、或添加代謝產(chǎn)物來起到防腐保鮮的作用。乳酸菌自古以來就用于食品發(fā)酵和保藏,現(xiàn)在被視為公認(rèn)安全微生物(GRAS)。許多乳酸菌除產(chǎn)生乳酸、乙酸和雙乙酰等抗菌物質(zhì)外,還可產(chǎn)生一些具有抑菌或殺菌作用的細(xì)菌素,如乳鏈球菌素、片球菌素等,但大多數(shù)細(xì)菌素的抑菌譜較窄,如Nisin主要只對革蘭氏陽性菌有抑制作用。近年來發(fā)現(xiàn)有些乳酸菌能產(chǎn)生另外一些廣譜抗菌物質(zhì),苯乳酸就是其中之一。更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)菌株的抗真菌活力不僅僅與產(chǎn)生的有機(jī)酸有關(guān),更是其它抗菌物質(zhì)的聯(lián)合作用。只有少數(shù)乳酸菌能產(chǎn)生一系列的抗真菌物質(zhì),而大部分乳酸菌沒有這個特性。因此推測這些菌株可能具有其獨(dú)特的代謝途徑。本研究中60株乳酸菌有7株對Penicilliumsp.和momursp.菌顯示出一定程度的抑制活性,對其中抑菌性能最好的菌株AST