鎖陽(yáng)多糖提取工藝研究

鎖陽(yáng)多糖提取工藝研究

它通常被稱為“老花”，也被稱為“不老藥”。它也被稱為鐵錘、銹鐵棒、地毛球、羊圈拉、烏蘭高腰（蒙古語(yǔ)）。這是鎖陽(yáng)科鏈陽(yáng)多年生肉質(zhì)的寄生草本植物，主要寄生在燕科白刺科。主要分布于土壤缺乏有機(jī)質(zhì)而富含鹽分的荒漠沙區(qū)地帶,主產(chǎn)于甘肅、新疆、青海、寧夏、內(nèi)蒙古等地,其中尤其以甘肅河西走廊地區(qū)分布最廣?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明,鎖陽(yáng)具有促進(jìn)性功能和腎功能;耐缺氧、抗應(yīng)激、抗疲勞作用;清除體內(nèi)自由基、抗氧化、抗衰老作用;抑制血小板聚集;調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng);潤(rùn)腸通便作用;抗癌及抑制艾滋病病毒增殖的等作用。鎖陽(yáng)中含有的主要有效成分有以兒茶素為代表的黃酮類、原兒茶酸為代表的有機(jī)酸類、熊果酸為代表的三萜類、多糖與鞣質(zhì)等化合物。其中,鎖陽(yáng)多糖具有防癌、抗癌、提高機(jī)體免疫力、延緩衰老等作用,并對(duì)心血管系統(tǒng)有強(qiáng)心、降壓、保護(hù)心肌、抑制血栓形成和降血脂作用。近年來(lái),鎖陽(yáng)的保健價(jià)值已被廣泛重視,并成為保健食品和藥品的新原料,具有一定開(kāi)發(fā)潛力。本實(shí)驗(yàn)以鎖陽(yáng)多糖含量為考察指標(biāo),采用L9(33)正交試驗(yàn)法優(yōu)選鎖陽(yáng)多糖的提取工藝,確定最佳提取條件,并對(duì)不同地區(qū)鎖陽(yáng)中多糖含量進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)研究認(rèn)為可以將多糖作為控制鎖陽(yáng)藥材質(zhì)量的指標(biāo)性成分,為鎖陽(yáng)優(yōu)質(zhì)藥材的選擇和綜合開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1藥品、化學(xué)品試劑鎖陽(yáng)原料采自或購(gòu)于甘肅河西走廊各地,由蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志剛教授鑒定為CynomoriumsongaricumRupr.。D-葡萄糖對(duì)照品(批號(hào):110833-200904)中國(guó)藥品生物制品檢定所,供含量測(cè)定用,含量以100%計(jì)(置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12h以上使用);苯酚(AR)宜興市化學(xué)試劑廠有限公司;硫酸(AR)西安化學(xué)試劑廠;無(wú)水乙醇(AR)天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心;乙醇(AR)天津市化學(xué)試劑二廠;乙醚(AR)天津市百世化工有限公司;丙酮(AR)西安市福晨化學(xué)試劑有限公司;五氧化二磷(AR)天津市大茂化學(xué)試劑廠;實(shí)驗(yàn)用水為超純水,由純水發(fā)生器制得。1.2實(shí)驗(yàn)儀器U-3900H型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)日本島津公司;Metler-D2025型十萬(wàn)分之一電子天平梅特勒儀器上海公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;SHB-Ⅲ型水循環(huán)式多用真空泵鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱北京科偉永興儀器有限公司;DZF-6020型真空干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HHS-24型電熱恒溫水浴鍋江蘇大地自動(dòng)化儀器廠;PTHW型電熱套鞏義市英峪予華儀器廠;信強(qiáng)牌多功能高速粉碎機(jī)上海廣沙工貿(mào)有限公司;SB2200-T型超聲波提取器(輸入功率90W)上海必能信超聲有限公司;UPS-Ⅱ型優(yōu)普UPS系列純水系統(tǒng)成都超純科技有限公司。1.3方法1.3.1提取樣品的制備將采集的鎖陽(yáng)材料分別清洗干凈,切塊,自然晾干,粉碎成粗粉,備用。具體方法是取鎖陽(yáng)粗粉9份,每份約20g,分別用乙醇100mL回流提取2次,每次2h,除去單糖、低聚糖及苷類等干擾性成分后,殘?jiān)凑辉囼?yàn)方案提取,水提液濃縮至約30mL,加入乙醇,使含醇量達(dá)到80%,冰箱中放置過(guò)夜后離心,沉淀分別用無(wú)水乙醇、乙醚、丙酮依次洗滌,50℃減壓烘干,作為正交試驗(yàn)樣品。1.3.2單因素鎖陽(yáng)糖提取試驗(yàn)1.3.2.添加總多糖含量對(duì)葉片多糖得率的影響料液比分別為1:5、1:10、1:15、1:20、1:25(g/mL),按照提取制備方法提取2次,每次90min,測(cè)定其多糖得率(mg/g)。1.3.2.不同提取液對(duì)小鼠多糖得率影響在料液比為1:15(g/mL)的提取條件下,分別提取30、60、90、120、150min,分別提取2次,合并提取液,測(cè)定其多糖得率/(mg/g)。1.3.2.3.提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響分別在料液比為1:15,每次90min的提取條件下進(jìn)行1、2、3、4、5次提取,合并提取液,測(cè)定其多糖得率(mg/g)。1.3.3最佳提取條件的確定采用硫酸苯酚比色法。試驗(yàn)以溶液吸光度為指標(biāo),選擇對(duì)提取率影響較大的3個(gè)因素料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)做正交試驗(yàn)。以鎖陽(yáng)多糖得率(mg/g)為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選鎖陽(yáng)多糖的最佳提取條件。選取料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)作為考察因素,采用L9(33)正交表進(jìn)行試驗(yàn),見(jiàn)表1。1.3.4最佳提取工藝的確定按1.3.5節(jié)方法分別測(cè)定正交試驗(yàn)樣品中多糖得率,確定最佳提取工藝,按照最佳提取工藝方法分別提取供試樣品。精密稱取鎖陽(yáng)多糖供試樣品約20mg于50mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得供試樣品溶液。1.3.5硫酸苯酚法顯色產(chǎn)物的最大特征吸收波長(zhǎng)的確定取置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12h的D-葡萄糖49.36mg,精密稱定,置100mL容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液(每1mL含D-葡萄糖0.4936mg)。精密量取上述對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL和7.0mL,分別置于25mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻。分別精密量取上述溶液各2mL,分別加入5%苯酚溶液1.0mL,搖勻,迅速加入7.0mL濃硫酸,搖勻后放置5min,水浴加熱30min,取出,冰水浴中冷卻至室溫,選擇中間質(zhì)量濃度的溶液于450~550nm的波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描,確定標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)硫酸苯酚法顯色后產(chǎn)物的最大特征吸收波長(zhǎng)。并在該波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)硫酸苯酚法顯色后產(chǎn)物的吸光度,每個(gè)質(zhì)量濃度梯度平行測(cè)定3次,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3.6多糖含量測(cè)定采用硫酸苯酚比色法,分別精密量取供試樣品溶液2mL,測(cè)定鎖陽(yáng)供試樣品溶液經(jīng)硫酸苯酚法顯色后產(chǎn)物的吸光度,將結(jié)果代入回歸方程中,計(jì)算多糖得率。鎖陽(yáng)中多糖得率為鎖陽(yáng)粗粉中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù),即1g鎖陽(yáng)中所含多糖的質(zhì)量/mg,計(jì)算公式:2結(jié)果與分析2.1d-葡萄糖法顯色結(jié)果按照文獻(xiàn)方法于450~550nm的波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描,確定D-葡萄糖對(duì)照品經(jīng)硫酸苯酚法顯色后產(chǎn)物的最大特征吸收波長(zhǎng)為486nm,結(jié)果見(jiàn)圖1。本實(shí)驗(yàn)以此為標(biāo)準(zhǔn)吸光度來(lái)確定鎖陽(yáng)多糖得率。2.2回歸方程d-葡萄糖D-葡萄糖對(duì)照品經(jīng)硫酸苯酚法顯色后產(chǎn)物的最大特征吸收波長(zhǎng)為486nm。以對(duì)照品質(zhì)量濃度/(μg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,D-葡萄糖的回歸方程為:Y=0.0553X+0.0232,r=0.9985。結(jié)果表明,D-葡萄糖對(duì)照品質(zhì)量濃度在3.95~27.64μg/mL時(shí),與吸收度具有良好的線性關(guān)系,結(jié)果見(jiàn)圖2。2.3單因素試驗(yàn)2.3.1料液比的確定如圖3所示,采用不同料液比進(jìn)行提取,多糖提取得率有差別,料液比實(shí)際上是溶劑的用量大小,一般溶劑的用量越大提取得率也越大,但是過(guò)多的溶劑用量會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi),綜合考慮,選擇1:10~1:20(g/mL)料液比作為操作條件。2.3.2提取時(shí)間的延長(zhǎng)如圖4所示,鎖陽(yáng)多糖得率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,達(dá)到90min時(shí)得率最高,然后隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)略呈下降趨勢(shì)。時(shí)間的延長(zhǎng),有助于傳質(zhì)過(guò)程,使分子充分?jǐn)U散,有利于多糖物質(zhì)的溶出;但隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),也可能導(dǎo)致部分多糖物質(zhì)的分解或部分其他物質(zhì)的溶解而使鎖陽(yáng)多糖得率下降。所以選擇30~90min作為提取操作條件。2.3.3提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響如圖5所示,采用不同提取次數(shù)進(jìn)行提取時(shí)多糖提取得率有差別,一般提取得率隨提取次數(shù)增加而升高,為節(jié)約溶劑和能源,綜合考慮,選擇1~3次作為提取操作條件。2.4鎖陽(yáng)多糖的提取工藝采用正交試驗(yàn)優(yōu)化鎖陽(yáng)多糖提取工藝的結(jié)果見(jiàn)表2,方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表2和表3極差分析結(jié)果表明,A、B、C三個(gè)因素對(duì)鎖陽(yáng)多糖提取影響的主次關(guān)系為:提取次數(shù)>料液比>提取時(shí)間。提取次數(shù)、料液比和提取時(shí)間對(duì)鎖陽(yáng)多糖的提取效率都有一定影響,提取的最佳工藝為A2B3C2,即料液比1:15、提取時(shí)間90min、提取次數(shù)為2次。用該條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(樣品產(chǎn)地:甘肅張掖市),多糖得率為43.39mg/g。2.5精密度實(shí)驗(yàn)精密量取對(duì)照品溶液2mL,共6份,按1.3.5節(jié)方法測(cè)定,結(jié)果吸收度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.27%,表明本方法精密度良好。2.6重復(fù)實(shí)驗(yàn)精密量取同一供試品溶液2mL,共6份,按1.3.5節(jié)方法測(cè)定,吸收度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.34%,表明本方法重現(xiàn)性良好。2.7吸收度測(cè)定值精密量取供試品溶液2mL,按1.3.5節(jié)方法操作,每10min測(cè)1次吸收度,到1h后改為20min測(cè)一次,吸收度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.59%,測(cè)定值在120min內(nèi)基本保持穩(wěn)定。以下吸光度測(cè)定均在120min內(nèi)完成。2.8提取試驗(yàn)樣品精密稱取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的鎖陽(yáng)粉末(甘肅張掖市)6份,各約5g,編號(hào)1~6,每2份為1組。分別加入對(duì)照品溶液10.0、15.0、20.0mL,按照最佳提取工藝方法分別提取回收試驗(yàn)樣品。分別精密稱取鎖陽(yáng)多糖回收試驗(yàn)樣品約20mg于50mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,得回收試驗(yàn)樣品溶液1~6。依法測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果均值為98.39%,RSD為0.94%,結(jié)果見(jiàn)表4。2.9稀釋、搖勻、調(diào)勻精密量取供試品溶液5mL于25mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻。精密量取上述溶液2mL,按1.3.5節(jié)方法測(cè)定,吸光度代入回歸方程計(jì)算多糖含量,結(jié)果見(jiàn)表5。3最佳工