高效液相色譜法同時測定中藥鎖陽中沒食子酸和原兒茶酸的含量

高效液相色譜法同時測定中藥鎖陽中沒食子酸和原兒茶酸的含量

鎖陽通常被稱為“不老藥”，也稱為銹鐵棒、地毛球和羊圈拉。這是鎖陽科植物鎖陽cyboriuscyborius的干燥肉質(zhì)莖，分布在甘肅省、新疆、內(nèi)蒙古、青海、寧夏等地。產(chǎn)于河西走道沙地、騰格里沙漠和渾山達克沙地西部。尤其是甘肅河西走道走廊生產(chǎn)的鎖陽，由于其良好的療效，被歷代中醫(yī)視為鎖陽道教的發(fā)源地。它具有補充腎陽、益血、潤腸排便的功效。臨床上主要用于腰膝酸軟、陽虛、滑精、腸干渴、大便等疾病，療效明顯。近年來,隨著光譜技術的發(fā)展,鎖陽的化學成分才被逐步揭示,而且對其藥理作用也有了更廣泛的認識。這些對測定鎖陽的有效成分,建立鎖陽的質(zhì)量標準,保護和合理開發(fā)利用鎖陽資源都具重要的意義。研究表明,鎖陽能夠促進人體細胞再生和新陳代謝,增強免疫調(diào)節(jié)能力,在防癌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、防治心血管疾病、治療白細胞減少等方面具有重要價值。鎖陽中含有的沒食子酸具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤作用;原兒茶酸具有增加冠脈流量、降低心肌耗氧量的作用,在體外具有明顯抑制血小板聚集的活性和抗菌活性,它們的藥理作用與鎖陽的主要藥理作用相吻合。目前在國內(nèi),鎖陽中沒食子酸、原兒茶酸的HPLC含量測定方法尚未見文獻報道。筆者以沒食子酸、原兒茶酸為對照品,建立了HPLC法同時測定鎖陽中沒食子酸、原兒茶酸的含量測定方法,方法簡便,結(jié)果準確、可靠,可為控制該藥材和飲片的內(nèi)在質(zhì)量提供參考依據(jù),從而為鎖陽藥材的質(zhì)量評價和資源的合理開發(fā)利用提供科學依據(jù)。1儀器和試劑盒1.1dad治理裝置Agilent1100高效液相色譜儀:包括G1311A四元泵,G1315ADAD檢測器,Agilent1100化學工作站;U-3900H日立紫外可見分光光度計;十萬分之一電子天平(Metler-D2025型);超聲波提取器(SB2200-T,上海必能信超聲有限公司)。1.2對照品和分析純沒食子酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號110831-200302);原兒茶酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號110809-200102);乙腈為色譜純;水為重蒸餾水;其余試劑均為分析純;鎖陽藥材由蘭州大學藥學院馬志剛教授鑒定為CynomoriumsongaricumRupr。2方法和結(jié)果2.1流動相的優(yōu)化260nm;流動相:乙腈-水-冰醋酸(5∶95∶0.1);流速:0.8mL·min-1;柱溫:室溫;進樣量:10μL;在流動相的優(yōu)化中,選用了乙腈-水-冰醋酸系統(tǒng)的不同配比(15∶85∶0.1,10∶90∶0.1,10∶100∶0.1和5∶95∶0.1)進行實驗,結(jié)果隨著乙腈體積分數(shù)的降低,沒食子酸和原兒茶酸的保留時間增加,并與雜質(zhì)峰的分離度增大,當乙腈-水-冰醋酸為5∶95∶0.1時,能夠獲得好的分離效果和短的分離時間,所以選擇此流動相系統(tǒng)作為本實驗的流動相;外標法定量(見圖1)。2.2對照品儲備溶液精密稱取沒食子酸對照品13.00mg,置于50mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,超聲處理10min,放至室溫,作為沒食子酸對照品儲備溶液;精密稱取原兒茶酸對照品13.32mg,置于50mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,超聲處理10min,放至室溫,作為原兒茶酸對照品儲備溶液;精密吸取上述2種對照品儲備溶液各5mL,置于50mL量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,作為對照品混合溶液(每1mL含沒食子酸26.00μg,每1mL含原兒茶酸26.64μg)。2.3樣品溶液的制備取供試品粉末(過三號篩)約1.0g,精密稱定,加水50mL回流提取2次,每次1h,合并提取液,水浴濃縮至約10mL,加鹽酸調(diào)節(jié)pH至3,置分液漏斗中,用乙醚輕輕振搖提取4次(25,25,25和20mL),合并提取液,低溫揮干乙醚,殘渣用流動相洗至10mL量瓶中,用流動相稀釋至刻度,超聲處理10min,放至室溫,備用。2.4標準曲線及線性范圍精密吸取上述2種對照品儲備溶液2.0,4.0,6.0,8.0和10.0mL(分別含沒食子酸0.520,1.040,1.560,2.080和2.600mg;含原兒茶酸0.533,1.066,1.599,2.132和2.665mg),分別置于50mL量瓶中,用流動相做梯度稀釋,超聲處理10min,放至室溫。精密吸取上述5種對照品混合溶液各10μL,注入液相色譜儀,測定上述2種對照品的峰面積值。以對照品進樣量(m,μg)為橫坐標,以峰面積值(A)為縱坐標進行線性回歸,得沒食子酸的回歸方程為:A1=1994.9m1+15.6,r1=0.9998;原兒茶酸的回歸方程為:A2=3774.0m2+36.2,r2=0.9999。結(jié)果表明,沒食子酸和原兒茶酸對照品進樣量分別在0.104～0.520和0.107～0.538μg時,與峰面積值具有良好的線性關系。按信噪比S/N=3,最低檢出限均為0.005和0.005μg。2.5儀器精密度試驗精密吸取對照品混合溶液10μL,在確定的色譜條件下重復進樣5次,測定峰面積值,求得沒食子酸和原兒茶酸RSD分別為0.75%和0.68%,儀器精密度良好。2.6算法重現(xiàn)性結(jié)果取同一樣品(甘肅酒泉)6份,按2.3項下制備,進樣,分析,結(jié)果平均含量沒食子酸為0.30mg·g-1,RSD為0.77%,原兒茶酸為0.39mg·g-1,RSD為0.65%,說明本方法的重現(xiàn)性良好。2.7原兒茶酸含量取上述樣品在4,8,12,24和48h分別測定,結(jié)果24h內(nèi)沒食子酸平均含量為0.30mg·g-1,RSD為0.77%;48h內(nèi)平均含量為0.30mg·g-1,RSD為0.56%;24h內(nèi)原兒茶酸平均含量為0.39mg·g-1,RSD為0.65%;48h內(nèi)平均含量為0.38mg·g-1,RSD為0.68%,說明被測樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.8加樣回收率和精密度取已知含量的樣品(甘肅酒泉),共5份。各加入一定量的對照品溶液,按確定的方法提取得到樣品溶液,按2.3項下制備,進樣,分析,結(jié)果沒食子酸的加樣回收率為97.15%,RSD為1.61%;原兒茶酸的加樣回收率為97.26%,RSD為0.89%。2.9鎖陽藥材、飲片的鎖陽體測定照供試品溶液制備方法制備15批供試品溶液,分別取配制好的對照品溶液和供試品溶液,精密吸取10μL進樣,用峰面積按外標法計算,被測鎖陽藥材、飲片中沒食子酸和原兒茶酸的含量,結(jié)果見表1。3提取方法的確定系統(tǒng)性實驗時,由DAD檢測器收集到的信息可知,沒食子酸在218和273nm處均有最大吸收;原兒茶酸在220,260和295nm處均有最大吸收,且在260nm處的靈敏度較高,沒食子酸在此波長處也有很好的吸收,故確定260nm為檢測波長。在確定色譜分離條件時,對甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸等不同流動相進行多次選擇比較,確定本文的檢測條件,沒食子酸、原兒茶酸能夠達到基線分離,峰形好,保留時間相對適中,分離度較好,與甲醇-水-冰醋酸液比較,柱壓明顯降低,其它成分無干擾。筆者嘗試以回流、超聲、冷浸提取方法進行比較,回流方法可有效提取原兒茶酸,提取效率遠遠大于超聲、冷浸提取法,所以采用回流提取法。以甲醇-冰醋酸(100∶1),30%乙醇-冰醋酸(100∶1),50%乙醇-冰醋酸(100∶1),0.1mol·L-1鹽酸溶液、水等作為回流提取溶劑;乙醚、乙酸乙酯、乙酸乙酯-乙醇(5∶1)作為萃取溶劑;提取時間、提取體積作為影響因素,對提取方法進行優(yōu)選實驗,從優(yōu)化結(jié)果來看,最終確定采用水回流提取,以乙醚萃取,蒸干溶劑,加定量流動相溶解后進樣的方法進行測定,可有效分離出沒食子酸、原兒茶酸,減少了部分非測定物質(zhì)的干擾。萃取次數(shù)的比較,選定萃取4次,結(jié)果表明4次可完全提出,減少提取次數(shù),會增大測定誤差。測定結(jié)果表明,10批藥材和5批飲片中均含有沒食子酸