宮頸組織中p21蛋白表達(dá)與高危hpv感染的相關(guān)性研究

宮頸組織中p21蛋白表達(dá)與高危hpv感染的相關(guān)性研究

宮頸是女性最常見(jiàn)的腫瘤之一。世界上每年約有50萬(wàn)例新發(fā)現(xiàn)妊娠性宮頸，中國(guó)的發(fā)病率和死亡率約占世界的三分之一。我國(guó)宮頸癌發(fā)病呈現(xiàn)兩大趨勢(shì):發(fā)病率越來(lái)越高,每年浸潤(rùn)性宮頸癌新發(fā)病例約13萬(wàn),另一方面發(fā)病年齡越來(lái)越年輕。高危HPV感染是宮頸癌的主要致癌因子,HPV16、HPV18在宮頸癌中有較高檢出率。有關(guān)HPV與一些凋亡抑制蛋白的研究指出兩者對(duì)宮頸癌的發(fā)生起協(xié)同作用。p21waf是1993年發(fā)現(xiàn)并克隆的細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子(cyclin-dependentkinasinhibitor,CD2KI)的家族成員,它參與細(xì)胞的多種功能活動(dòng)。本研究采用基因雜交捕獲Ⅱ代技術(shù)(HC-Ⅱ)檢測(cè)高危HPV感染及免疫組化方檢測(cè)p21waf基因表達(dá)蛋白P21在正常宮頸組織、宮頸炎、CIN、及宮頸癌中的表達(dá)特點(diǎn)及相互關(guān)系,初步探討兩者在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。材料和方法1.he切片鑒定選取華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科2005年2月至2007年5月宮頸手術(shù)或活檢患者。標(biāo)本均經(jīng)本院病理科醫(yī)師復(fù)閱HE切片證實(shí)。其中正常組織20例、宮頸炎17例、CIN23例、宮頸鱗癌26例。82例患者年齡27-49歲,中位年齡33歲。所有標(biāo)本均進(jìn)行P21蛋白免疫組化檢測(cè)和HC-Ⅱ法高危型HPV檢測(cè)。2.tmdmaP21蛋白免疫組化試劑購(gòu)自江蘇碧云天公司,為即用型試劑。SP試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。美國(guó)Digene公司HybridCaptureSystem,型號(hào)DML2000TM。保存液為配套STM保存液。探針是由13種高危HPV組成的專利全長(zhǎng)RNA探針,包括:16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型?；蚪MDNA抽提試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司。3.抗羊抗兔u2005石蠟包埋標(biāo)本做4μm連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟至水,微波抗原修復(fù),血清封閉,P21蛋白兔抗人多克隆抗體1∶100,4℃孵育過(guò)夜,再以生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG37℃孵育15min,辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素37℃孵育30min,最后用DAB顯色,蘇木素復(fù)染,酒精逆度脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。每一步驟間均用pH7.4PBS緩沖液漂洗3次,每次5min。4.試劑盒說(shuō)明書(shū)首先提取石蠟切片中基因組DNA(方法參照QIAGENDNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū))。HC-Ⅱ是一種以堿性磷酸酶反應(yīng)為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附法,根據(jù)美國(guó)Digene公司制HPVDNAHC-Ⅱ方法(HybridcuptureⅡ,HC-Ⅱ),按說(shuō)明書(shū)操作。5.檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)p21蛋白免疫組化染色以宮頸癌細(xì)胞胞核中出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞,高倍鏡(×400)下綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量測(cè)定。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):不著色0分,棕黃色2分,黃褐色3分。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野,計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%者0分,10%-40%者1分,40%-70%者2分,≥70%者3分。兩種評(píng)分相加,0-1分為(-),2分為(+),3-4分為(廿),5-6分為(卅)。(-)為陰性,(+-卅)為陽(yáng)性。高危HPV檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)是1pgHPVDNA/ml(5000拷貝/ml)。檢測(cè)宮頸組織中HPV的13種高危亞型。6.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用χ2檢驗(yàn)和確切概率法檢驗(yàn),各組數(shù)據(jù)的差別采用成組設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis法),各組數(shù)據(jù)相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman相關(guān)分析,以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。p2p1蛋白在正常妊娠、宮頸炎、cin、及妊娠中表達(dá)情況1.高危HPV感染在不同宮頸組織中的檢出率如表1所示,高危HPV在正常宮頸、宮頸炎、CIN及宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為20%(4/20)、23.5%(4/17)、65.2%(15/23)及88.5%(23/26),高危HPV感染在正常宮頸組織、CIN及宮頸癌中的檢出率兩兩比較差異有顯著性意義(P<0.05),而在正常宮頸組織與宮頸炎中的檢出率差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。2.P21蛋白在4種不同宮頸組織中的表達(dá)免疫組化染色顯示P21蛋白呈棕黃色顆粒,定位于細(xì)胞核內(nèi),宮頸癌中P21染色陽(yáng)性細(xì)胞成團(tuán)分布,CIN中陽(yáng)性細(xì)胞彌散分布,正常宮頸組織及宮頸炎組織中未見(jiàn)明顯陽(yáng)性細(xì)胞(圖A,B,C)。P21蛋白在正常宮頸組織及宮頸炎中陽(yáng)性表達(dá)率分別為15%(3/20)和11.8%(2/17),CIN組織陽(yáng)性表達(dá)率為39.1%(9/23),宮頸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為57.7%(15/26),P21蛋白在正常宮頸組織、CIN及宮頸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率兩兩比較差異有顯著性意義(P<0.05),而在正常宮頸組織與宮頸炎中的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)(見(jiàn)表2)。3.在正常宮頸組織、宮頸炎、CIN、及宮頸癌組織中的P21蛋白表達(dá)與高危HPV感染的相關(guān)關(guān)系正常宮頸、宮頸炎、CIN、及宮頸癌組織中高危HPV感染陽(yáng)性組中P21蛋白陽(yáng)性率分別為50%(2/4)、50%(2/4)、53.3%(8/15)、65.2%(15/23)。而高危HPV感染陰性組中P21蛋白陽(yáng)性率分別為6.25%(1/16)、0%(0/13)、12.5%(1/8)、0%(0/3)。各級(jí)別宮頸組織中高危HPV陽(yáng)性組的P21蛋白陽(yáng)性率明顯高于陰性組的P21蛋白陽(yáng)性率。差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性意義(見(jiàn)表3)。討論1.p2p1wf-p3通過(guò)藥物轉(zhuǎn)導(dǎo)其表達(dá)P21waf基因是p53基因重要的下游基因之一,其表達(dá)產(chǎn)物P21蛋白是目前已知的具有最廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期抑制蛋白。在本研究中p21waf的產(chǎn)物P21蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率在正常宮頸組、宮頸炎、CIN、及宮頸癌組中依次增加,分別為11.8%、15.4%、39.1%和57.7%,差異有顯著性意義(P<0.05)。這表明隨著宮頸病變惡性程度的增加,P21蛋白陽(yáng)性率依次升高。有研究認(rèn)為,野生型p53失活時(shí),突變型的p53對(duì)p21waf基因調(diào)控作用失常,干擾p21waf基因轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致其過(guò)度表達(dá)繼而使P21蛋白表達(dá)異常增多;突變型的p53還可以與宿主細(xì)胞DNA發(fā)生高親和度的非特異性結(jié)合,進(jìn)而影響P21與cyclin、CDK結(jié)合,使損傷的細(xì)胞不能依靠阻滯G1期來(lái)修復(fù)受損的DNA,從而導(dǎo)致細(xì)胞DNA的錯(cuò)誤復(fù)制、細(xì)胞異化或惡變,細(xì)胞周期調(diào)控失常,導(dǎo)致細(xì)胞的無(wú)限增殖,從而產(chǎn)生惡性腫瘤。另外p53陰性細(xì)胞株在某些生長(zhǎng)因子如(PDGF、EGF、TGF-β)等刺激下,也可刺激p21waf表達(dá),表明p21waf還可通過(guò)非依賴p53途徑參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、衰老及DNA損傷修復(fù)等多種功能。本研究提示P21蛋白可能參與了從正常宮頸組織、宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌多階段多步驟的發(fā)展過(guò)程并起到重要作用。2.高危pv感染機(jī)制高危HPV感染生殖道是生殖道腫瘤(尤其是宮頸癌)高危因素之一,是95%宮頸癌的原發(fā)因素。目前已經(jīng)鑒定出HPV亞型有100多種,與生殖道病變相關(guān)的有30多種,其中高危HPV16、18、52、58型的感染與宮頸癌密切相關(guān)。許多研究表明,高危HPV感染是宮頸癌變的第一步,主要通過(guò)病毒基因蛋白與細(xì)胞癌基因和抑癌基因相互作用,干擾細(xì)胞的正常周期監(jiān)測(cè)機(jī)制,使宿主細(xì)胞獲得異常增殖能力而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,是高危HPV致癌的中心環(huán)節(jié)。本研究中,高危HPV在正常宮頸組織、宮頸炎、CIN、及宮頸癌中的檢出率依次增高,分別為20%、23.5%、65.2%及88.5%,差異有顯著性意義(P<0.05),由此可見(jiàn)高危HPV感染是宮頸癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素,與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。3.s1dv與p3基因表達(dá)的互動(dòng)關(guān)系正常宮頸、宮頸炎、CIN、宮頸癌中高危HPV感染陽(yáng)性組P21蛋白陽(yáng)性率分別為50%、50%、53.3%、65.2%,而高危HPV感染陰性的各組中P21蛋白陽(yáng)性率分別為6.25%、0%、12.5%、0%。各級(jí)別宮頸組織中高危HPV陽(yáng)性組的P21蛋白陽(yáng)性率明顯高于陰性組的P21蛋白陽(yáng)性率,差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性意義(P<0.05)。由此可見(jiàn)高危HPV感染與P21蛋白的表達(dá)具有明顯正相關(guān)性。高危HPV感染直接或間接影響P21表達(dá)的可能的機(jī)制是:高危HPV的E6可與P53蛋白結(jié)合,從而使pRb與p53喪失對(duì)p21waf的調(diào)節(jié)作用,高危HPV還通過(guò)E7蛋白與宿主細(xì)胞P21結(jié)合,促進(jìn)p21降解,但在功能上,這與p21的突變或缺失是一樣的,都會(huì)導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的喪失,是惡變發(fā)生的一個(gè)重要的內(nèi)源性促進(jìn)因素。因此理論上P21蛋白在CIN和宮頸鱗癌中的檢出率應(yīng)該很低,然而不同的研究卻有爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)顯示在正常宮頸鱗狀上皮僅能見(jiàn)少數(shù)p21陽(yáng)性細(xì)胞(<5%)散在分布于基底及副基底層,從宮頸炎、CIN到宮頸癌,其陽(yáng)性率分別為11.8%、39.1%和57.7%,與部分研究結(jié)果一致,提示宮頸病變中p21蛋白水平的升高是個(gè)復(fù)雜事件。E6和E7蛋白使p53和pRb失活后,可誘導(dǎo)p14ARF蛋白表達(dá)上調(diào),而p14ARF反過(guò)來(lái)抑制MDM2