腸道細(xì)菌在2型糖尿病患者中的作用

腸道細(xì)菌在2型糖尿病患者中的作用

隨著社會的發(fā)展和人們生活方式的改變，糖尿病和肥胖等代謝疾病迅速發(fā)展，已成為世界著名的社會問題。2011年中國糖尿病協(xié)會最新調(diào)查發(fā)現(xiàn),中國糖尿病發(fā)病率高達(dá)9.7%,全國糖尿病患者達(dá)到1億例,糖尿病及其慢性并發(fā)癥對人類健康產(chǎn)生極大的危害,給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。近年來隨著研究的逐步深入,人們發(fā)現(xiàn)糖尿病和肥胖以胰島素抵抗和低水平炎癥反應(yīng)為特征,而腸道菌群與宿主間在調(diào)節(jié)能量平衡、炎癥反應(yīng)方面存在著密切聯(lián)系,因此人們推測腸道菌群和肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究擬觀察2型糖尿病患者與健康志愿者間腸道菌群的差異,分析腸道菌群與空腹血糖之間的關(guān)系,探討腸道細(xì)菌在2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮的作用。1數(shù)據(jù)和方法1.1糞便標(biāo)本來源采集惠州市第一人民醫(yī)院2012年1—6月綜合內(nèi)科、老干部科、健康管理中心共計2型糖尿病患者(糖尿病組)55例、健康志愿者(對照組)57例糞便標(biāo)本。其中,糖尿病組男32例,女23例,年齡(58±11)歲,空腹血糖(7.56±0.39)mmol/L;對照組男32例,女25例,年齡(57±13)歲,空腹血糖(5.26±0.08)mmol/L。1.2慢性毒性疾病糖尿病組納入標(biāo)準(zhǔn)參考1999年WHO的診斷標(biāo)準(zhǔn),確診為2型糖尿病患者并排除特殊類型糖尿病和妊娠期糖尿病。對照組納入健康人,并排除急慢性肝膽及其他消化道疾病,常規(guī)檢查無異常者。研究對象采樣前1個月內(nèi)未使用抗生素,近2周內(nèi)無服用益生元、益生菌等制品;近1個月內(nèi)無腹瀉、便秘、痢疾等胃腸道疾病。1.3方法1.3.1樣品采集所有研究對象的糞便標(biāo)本均于排便后2h內(nèi)收集在密閉的糞便儲存盒內(nèi),將上述標(biāo)本迅速儲存于-80℃低溫冰箱中。1.3.2小鼠腸道dna的提取將糞便標(biāo)本放在冰上解凍,按TIANampStoolDNAKit(TIANGEN)產(chǎn)品說明書,每例糞便稱取200mg,提取糞便基因組DNA,置于-20℃冰箱保存。1.3.3pcr索引設(shè)計1.3.4熒光定量pcr反應(yīng)將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)10倍稀釋,獲得101～107系列拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。應(yīng)用RocheLightCycler480定量PCR儀、RocheLightCycler480SYBRGreenMasterMix試劑盒進(jìn)行定量擴(kuò)增。反應(yīng)體系20μL:SYBRGreenMasterMix10μL、上下游引物各1μL、模板DNA5μL、ddH2O3μL。反應(yīng)條件為:(1)預(yù)變性:95℃5min1個循環(huán);(2)擴(kuò)增:變性95℃10s、退火溫度(表1)20s、延伸72℃30s共45個循環(huán)。反應(yīng)完畢后進(jìn)行熔解曲線分析。將待測糞便DNA稀釋為5ng/μL濃度作為定量PCR反應(yīng)模板,在上述反應(yīng)體系、反應(yīng)條件下進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增。結(jié)果以細(xì)菌拷貝數(shù)的常用對數(shù)lg/g糞便表示。1.4不服從正態(tài)分布資料應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,正態(tài)分布資料以xˉ±sxˉ±s表示,兩樣本間比較采用t檢驗。不服從正態(tài)分布資料用M(P25,P75)表示,兩樣本的比較采用Mann-WhitneyU檢驗。相關(guān)關(guān)系分析用Spearman相關(guān)。雙側(cè)P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1各組大腸桿菌屬、球形梭桿菌群、乳酸桿菌屬數(shù)量比較兩組腸道細(xì)菌總量極為相似,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較,糖尿病組大腸桿菌屬數(shù)量輕度增加,球形梭菌類群、乳酸桿菌屬數(shù)量輕度減少,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。糖尿病組柔嫩梭菌類群、雙歧桿菌屬、腸球菌屬數(shù)量顯著高于對照組(P<0.005),擬桿菌屬數(shù)量顯著低于對照組(P=0.007)。見表2。2.2總細(xì)菌比例比較糖尿病組擬桿菌屬/球形梭菌、柔嫩梭菌類群、雙歧桿菌屬、腸球菌屬占總細(xì)菌比例均高于健康對照組,乳酸桿菌屬、大腸桿菌屬占總細(xì)菌比例均低于對照組,其中擬桿菌屬/球形梭菌、柔嫩梭菌類群、腸球菌屬占總細(xì)菌比例在兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。2.32空腹血糖和空腹血糖屬數(shù)量的相關(guān)性表1擬桿菌屬/球形梭菌占總細(xì)菌比例(r=-0.202,P=0.033),擬桿菌屬數(shù)量(r=-0.246,P=0.009)與空腹血糖呈負(fù)相關(guān),腸球菌屬數(shù)量(r=0.221,P=0.019)、腸球菌屬占總細(xì)菌比例(r=0.213,P=0.013)與空腹血糖間呈正相關(guān),而其他菌屬與空腹血糖相關(guān)關(guān)系不顯著。3空腹血糖檢測人體腸道菌群是通過長期進(jìn)化在宿主體內(nèi)形成的定植微生物群落。腸道眾多的益生菌和共生菌在腸道黏膜形成十分重要的菌膜,對人體的營養(yǎng)物質(zhì)代謝、免疫賦活、合成機(jī)體必需的一些維生素和微量元素、抵御致病菌侵入、分解代謝腸道中的有害物質(zhì)等方面起著不可替代的作用。大量研究(主要在動物模型中)表明腸道菌群可能通過系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)宿主能量代謝、調(diào)節(jié)腸源性激素如腸源性肽、胰高血糖素樣肽的分泌等多種機(jī)制參與肥胖、糖尿病的發(fā)生、發(fā)展。本研究針對腸道菌群中厚壁菌門(球形梭菌類群、柔嫩梭菌類群)和擬桿菌門(擬桿菌屬)主要兩大門類細(xì)菌(占總細(xì)菌比例>85%)進(jìn)行熒光定量PCR,比較2型糖尿病人群和健康人群(空腹血糖正常人群)腸道菌群構(gòu)成。由于在某些樣本中,球形梭菌類群和擬桿菌菌屬數(shù)量超過總細(xì)菌數(shù)量,可能是由于擴(kuò)增總細(xì)菌的通用引物特異性并不足以代表整個腸道菌群,而造成得到的總細(xì)菌數(shù)量偏低,或是用于擴(kuò)增擬桿菌屬和球形梭菌屬的引物特異性較差,目的片段的擴(kuò)增中也混有其他的細(xì)菌。為了克服這一缺陷,比較球形梭菌類群和擬桿菌屬占總細(xì)菌比例時,采用擬桿菌屬/球形梭菌進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩類人群中腸道細(xì)菌總數(shù)、球形梭菌類群數(shù)量存在差異,柔嫩梭菌類群數(shù)量在2型糖尿病患者中顯著增加,而擬桿菌屬數(shù)量顯著降低,且擬桿菌屬數(shù)量及擬桿菌屬/球形梭菌隨著空腹血糖升高顯著降低。根據(jù)既往分析發(fā)現(xiàn),瘦人消化道里的細(xì)菌主要屬于擬桿菌,胖人體內(nèi)的擬桿菌比瘦人少一半,而厚壁菌更多。厚壁菌能夠從食物中“榨取”的能量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于擬桿菌屬,且減肥后患者擬桿菌數(shù)量增加而厚壁菌數(shù)量減少。且近來的進(jìn)一步研究顯示,擬桿菌能利用來源于食物顆粒、腸黏液層或是脫落的腸道上皮細(xì)胞,根據(jù)食物環(huán)境的多糖及單糖的變化,調(diào)節(jié)其基因組編碼的大量糖基水解酶、糖代謝過程酶,幫助宿主有效利用食物多糖,接種多形擬桿菌還可導(dǎo)致無菌動物回腸中葡萄糖共運輸?shù)鞍椎乃缴?這使得即使在相同腸內(nèi)葡萄糖含量情況下定植多形擬桿菌,可加快葡萄糖從腸道運往其他需要之處,更有利于宿主正常機(jī)能的完成,因而推測擬桿菌在的病理生理中應(yīng)有一定的作用。雖然本研究與LARSEN等的擬桿菌屬數(shù)量減少,代謝性內(nèi)毒素血癥水平、炎癥反應(yīng)程度明顯改善存在矛盾,但是與WU等針對中國2型糖尿病人群的研究得出的結(jié)果是一致的?？紤]可能是腸道菌群的構(gòu)成在極大程度上受到飲食習(xí)慣和人種基因的影響,東西方人種基因遺傳背景、飲食習(xí)慣差異造成這一相悖的研究結(jié)果。隨著研究的進(jìn)一步深入,在大量關(guān)于肥胖、2型糖尿病的動物和人體研究中,人們發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充益生菌、益生元制劑后,肥胖、2型糖尿病患者胰島素抵抗、代謝性內(nèi)毒素血癥、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)狀態(tài)得到顯著改善。因此筆者也將雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬等常見有益菌納入研究的范疇,發(fā)現(xiàn)2型糖尿病人群中乳酸桿菌屬含量和比例輕度低于健康人群,并沒有表現(xiàn)出之前CANI等在2型糖尿病小鼠動物模型、LARSEN等和SANTACRUZ等在2型糖尿病以及肥胖患者中所發(fā)現(xiàn)的乳酸桿菌屬比例隨著血糖升高明顯降低的情況。值得注意的是本研究發(fā)現(xiàn)在2型糖尿病患者雙歧桿菌屬含量顯著高于對照人群,但是與空腹血糖不存在顯著相關(guān)關(guān)系。這與WU等和黃旭東等研究結(jié)果是相反的,考慮可能存在以下幾個因素:(1)WU等的研究中僅納入16例2型糖尿病患者、12例健康人群,屬于小樣本研究,本研究的樣本含量為該研究的近3倍,擴(kuò)大樣本后,研究結(jié)果的趨勢發(fā)生了改變;(2)黃旭東等采用的是傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)的方式,以稀釋平板計數(shù)法和快速菌群鑒定法技術(shù),主觀因素對實驗結(jié)果影響較大,而本研究采取的是較為敏感及準(zhǔn)確的熒光定量PCR方法;(3)可能是2型糖尿病患者的機(jī)體在高血糖的狀態(tài)下,自身腸道菌群發(fā)生應(yīng)激性改變,導(dǎo)致雙歧桿菌屬數(shù)量顯著增加,以逆轉(zhuǎn)機(jī)體慢性炎癥反應(yīng)狀態(tài),改善代謝性內(nèi)毒素血癥。本研究還觀察大腸桿菌屬含量在健康人群中稍高,但在兩類人群中差異不顯著。而同為條件致病菌的腸球菌屬在2型糖尿病患者體內(nèi)數(shù)量及比例顯著增加,且隨著空腹血糖的升高而升高。近年來的研究表明,腸球菌是院內(nèi)感染的重要致病菌,不僅可引起尿路感染、皮膚軟組織感染,還可引起危及生命的腹腔感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎和腦膜炎等。腸球菌屬這一致病特性與2型糖尿病患者本身由于高血糖的狀態(tài),機(jī)體抵抗力低下,易于并發(fā)皮膚軟組織、泌尿系統(tǒng)等感染的疾病特征相符合。但是具體在糖尿病狀態(tài)下,腸球菌數(shù)量增加及與血糖的顯著正相關(guān)關(guān)系和糖尿病易于并發(fā)感染的病理機(jī)制是否相同或是存在重疊效應(yīng),目前的研究水平尚沒有得出結(jié)論。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者存在一定程度的腸道菌群失調(diào),且擬桿菌屬、擬桿菌屬/球形梭菌、腸球菌屬及其占總細(xì)菌比例與血糖存在顯著相關(guān)關(guān)系。根據(jù)本研究及之前的研究可以進(jìn)一步推測,腸道菌群在2型糖尿病發(fā)生發(fā)