乳酸桿菌的研究進(jìn)展

乳酸桿菌的研究進(jìn)展

蘑菇是人類和動(dòng)物腸道中非常重要的寄生蟲之一。這種菌是一種雙性厭氧的紅景天菌。這是一家重要的食品和醫(yī)療工程領(lǐng)域微生物，包括三種類型的乳酸菌、乳酸桿菌和雙殼菌。20世紀(jì)80年代,人們開始致力于乳酸菌生物學(xué)性質(zhì)和分子機(jī)制的研究,乳酸桿菌在農(nóng)業(yè)、食品領(lǐng)域所具有的重大經(jīng)濟(jì)意義及對(duì)人體和動(dòng)物健康的重要性,越來(lái)越引起人們的關(guān)注。隨著乳酸桿菌分子生物學(xué)的發(fā)展和電轉(zhuǎn)基因技術(shù)的建立,以及各類表達(dá)調(diào)控元件的分離和克隆,已經(jīng)建立和發(fā)展了一系列乳酸桿菌基因表達(dá)載體和傳遞系統(tǒng),為探索其新的應(yīng)用潛力提供了基礎(chǔ),其中利用乳酸桿菌作為抗原傳遞載體進(jìn)行粘膜疫苗免疫的研究,是該領(lǐng)域研究的前沿和熱點(diǎn)。本文主要對(duì)乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)方面的進(jìn)展作一綜述。1微生物指標(biāo)菌乳酸桿菌作為主要的益生菌廣泛應(yīng)用于食品及飼料加工業(yè),在功能食品、醫(yī)療保健、微生態(tài)制劑等領(lǐng)域的應(yīng)用具有誘人的前景。目前,乳酸桿菌制劑已被應(yīng)用于腸道的微生態(tài)治療。乳酸桿菌另一個(gè)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力的是作為免疫接種的疫苗載體。乳酸桿菌作為外源基因表達(dá)宿主菌,其優(yōu)越性主要表現(xiàn)在:①乳酸桿菌能在呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)定植,對(duì)維持微生態(tài)平衡具有重要作用;②在食品工業(yè)各個(gè)領(lǐng)域中長(zhǎng)期應(yīng)用已證實(shí)不具有致病性,被公認(rèn)為安全級(jí)(GRAS,generallyrecognizedassafe)微生物,身為食品級(jí)細(xì)菌,易構(gòu)建成食品級(jí)的基因克隆及表達(dá)系統(tǒng),可以有效提高基因工程產(chǎn)品的安全性,并可在一定程度上簡(jiǎn)化表達(dá)產(chǎn)物的后期處理工藝;③具有控制腸道感染、增加某些食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、控制血清膽固醇水平、改善乳糖代謝、誘導(dǎo)體內(nèi)特異性及非特異性免疫應(yīng)答以及抗腫瘤活性等功能;④同腸胃外免疫途徑相比,通過(guò)黏膜免疫,可以誘發(fā)IgA產(chǎn)生;⑤具有免疫佐劑作用、固有免疫原性及對(duì)膽汁酸的抵抗力。因此,乳酸桿菌作為基因工程受體菌的應(yīng)用前景十分廣闊。2糖代謝的發(fā)生乳酸桿菌的許多種類中均發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的存在,且多種乳酸桿菌均具有1個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒譜。用DNA-cDNA雜交和核苷酸序列分析證實(shí),各種質(zhì)粒之間具有不同程度的同源性,從而說(shuō)明質(zhì)粒間的橫向傳遞和重組是相當(dāng)頻繁的。最近幾年開展了有關(guān)質(zhì)粒與細(xì)菌特性關(guān)系的研究,發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒與某些表型,如抗藥性、N-乙酰氨基葡萄糖減緩酸的形成、糖苷的代謝、糖代謝、氨基酸代謝、細(xì)菌素產(chǎn)生與免疫等密切相關(guān)。大多數(shù)乳酸桿菌質(zhì)粒表現(xiàn)出分離穩(wěn)定性,尤其是小的隱性質(zhì)粒較大質(zhì)粒相對(duì)更加穩(wěn)定。經(jīng)研究表明乳酸桿菌質(zhì)粒具有如下特點(diǎn):①大多數(shù)乳酸桿菌質(zhì)粒均為隱蔽型質(zhì)粒,但已證明某些乳酸桿菌的細(xì)菌素、糖代謝有關(guān)的酶及抗生素抗性等都是由不同質(zhì)粒所決定的;②乳酸桿菌質(zhì)粒具有遺傳穩(wěn)定性;③乳酸桿菌中小型質(zhì)?？截悢?shù)高,一般可達(dá)30~50個(gè);④部分乳酸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子宿主范圍廣泛,可在其他種類的革蘭陽(yáng)性菌及大腸桿菌中發(fā)揮作用,避免了專一性質(zhì)粒在不同菌株之間使用時(shí)不必要的亞克隆;⑤乳酸菌屬的某些菌株的質(zhì)粒也可作為乳酸桿菌的質(zhì)粒,如由宿主范圍廣的乳酸球菌質(zhì)粒pGK12構(gòu)建出的乳酸桿菌基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng);⑥某些乳酸桿菌質(zhì)粒沒(méi)有宿主特異性,如pLP501、pLPE323適用于廣泛宿主范圍,可在不同種類乳酸桿菌中增殖,而且它們的擴(kuò)增拷貝數(shù)沒(méi)有明顯不同,這說(shuō)明其在不同宿主菌中DNA復(fù)制調(diào)控機(jī)制是相似的。表1列出了從乳酸桿菌中分離的質(zhì)粒及構(gòu)建的質(zhì)粒。3乳酸桿菌種的誘導(dǎo)表達(dá)隨著乳酸桿菌分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的發(fā)展,已分離出了乳酸桿菌的各種表達(dá)調(diào)控元件,對(duì)乳酸桿菌基因轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控及蛋白質(zhì)分泌機(jī)制有了進(jìn)一步的了解,并通過(guò)對(duì)部分質(zhì)粒DNA序列的測(cè)定,然后同已知序列質(zhì)粒的基因進(jìn)行比較來(lái)推測(cè)未知質(zhì)?；蚬δ艿耐緩?相繼開發(fā)出了乳酸桿菌的克隆載體、表達(dá)載體、整合載體。研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌質(zhì)?；蛑衅毡榇嬖趦煞N調(diào)控序列,一種是與基因復(fù)制起始相關(guān)的序列,主要包括兩大類:一類是編碼蛋白的開放閱讀框架ORF,在乳酸桿菌中與質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)的ORF之間存在同源性。另一類是與調(diào)控有關(guān)的非編碼序列,主要包括復(fù)制相關(guān)蛋白作用的靶序列、正-負(fù)向復(fù)制起始點(diǎn)、缺失位點(diǎn)、啟動(dòng)子等復(fù)制調(diào)控元件。其中乳酸桿菌的啟動(dòng)子對(duì)LAB具有高度的選擇性,故在LAB表達(dá)系統(tǒng)中,很少使用外源啟動(dòng)子,目前已成功用于表達(dá)外源蛋白的啟動(dòng)子有l(wèi)acA、lacR、lacF、T7、xylA、lacS、nisA/nisZ、nisF、usp等,這些啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物都是食品級(jí)的,如乳糖、木糖和Nisin等,易于構(gòu)成食品級(jí)LAB表達(dá)系統(tǒng),提高轉(zhuǎn)基因LAB工程菌株的安全性;另一種是控制質(zhì)?？截悢?shù)和不相容性的DNA序列。質(zhì)粒的拷貝數(shù)是由DNA非編碼序列中的重復(fù)序列和反轉(zhuǎn)錄RNA來(lái)控制的。除pLJ1外,所有質(zhì)粒都有與革蘭陽(yáng)性桿菌質(zhì)粒復(fù)制蛋白(Rep)相似的一種蛋白,根據(jù)復(fù)制蛋白的功能特性,及和其他質(zhì)粒復(fù)制蛋白結(jié)構(gòu)相似性,推測(cè)乳酸桿菌屬的小質(zhì)粒是以滾環(huán)(RCR)方式進(jìn)行復(fù)制的,可產(chǎn)生單股DNA中間體的積累。因此具有滾環(huán)復(fù)制所必需的復(fù)制啟動(dòng)元件,這些結(jié)構(gòu)包括正-負(fù)復(fù)制起始點(diǎn)、復(fù)制控制元件和移動(dòng)元件等,這些序列或元件與其他源于革蘭氏陽(yáng)性菌的質(zhì)粒的相應(yīng)區(qū)域的廣泛的同源性,推測(cè)乳酸桿菌質(zhì)粒的這些序列或元件是通過(guò)基因內(nèi)或基因間傳遞機(jī)制而獲得的。4食品級(jí)選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒載體傳統(tǒng)的乳酸菌載體都帶有一個(gè)或多個(gè)編碼特定抗生素(如紅霉素、氯霉素等)抗性的基因,如果將抗生素抗性基因投放到環(huán)境中或人和動(dòng)物體內(nèi),由于抗性因子的轉(zhuǎn)移,將帶來(lái)生物安全性的嚴(yán)重后果。為了防止使用抗生素抗性標(biāo)記所引起的危害,最有效的辦法是用安全的食品級(jí)標(biāo)記替代抗生素抗性標(biāo)記以建立食品級(jí)選擇性標(biāo)記的載體。因此,食品級(jí)乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成為該領(lǐng)域研究的前沿和熱點(diǎn),為了開發(fā)適用于人和動(dòng)物的食品級(jí)乳酸桿菌表達(dá)載體,研究者尋求構(gòu)建非抗生素標(biāo)記的質(zhì)粒載體,現(xiàn)在用于乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的食品級(jí)選擇性標(biāo)記主要有三類:糖類利用標(biāo)記、營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、編碼細(xì)菌素抗性,這樣構(gòu)建出的乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng),載體、受體及誘導(dǎo)物均為食品級(jí),可直接制成口服制劑。所以,食品級(jí)的乳酸桿菌工程菌可直接應(yīng)用于食品工業(yè)和醫(yī)藥保健等領(lǐng)域,有著巨大的應(yīng)用前景和潛在的商業(yè)價(jià)值。4.1d-木糖發(fā)酵糖類作為選擇標(biāo)記,主要是利用某種糖僅為少數(shù)乳酸桿菌利用,而其他乳酸桿菌不能利用其為發(fā)酵底物,將能發(fā)酵這種物質(zhì)的乳酸桿菌的基因克隆與乳酸桿菌的質(zhì)粒載體連接,轉(zhuǎn)化不能利用這種物質(zhì)的乳酸桿菌中進(jìn)行表達(dá),這樣就可通過(guò)該物質(zhì)作為底物來(lái)篩選。例如乳酸桿菌中有少數(shù)株系可利用D-木糖作為碳源,而且與木糖發(fā)酵有關(guān)的基因也研究得較為清楚。Posno等把可發(fā)酵木糖的戊糖乳酸桿菌MD353染色體上的xyl基因克隆到大腸桿菌-乳酸桿菌穿梭載體pLP3537,得到重組pLP3537-xyl質(zhì)粒,再將其轉(zhuǎn)入不能利用木糖的干酪乳酸桿菌ATCC393中,結(jié)果轉(zhuǎn)化子獲得了可利用木糖的能力,由此得到利用木糖發(fā)酵作為乳酸桿菌食品級(jí)選擇標(biāo)記。另外,Takala等使干酪乳酸桿菌的磷酸化β-牛乳糖酶基因缺失141bp,成為乳糖利用缺陷型,構(gòu)建的質(zhì)粒pLEB600含有來(lái)源于干酪乳酸桿菌的lacG基因和鼠李糖乳酸桿菌的lacG基因啟動(dòng)子。質(zhì)粒pLEB600轉(zhuǎn)化乳糖缺陷型干酪乳酸桿菌后即可互補(bǔ)利用乳糖。lacG基因起到選擇標(biāo)記的作用。4.2．質(zhì)粒的篩選一類為以細(xì)菌管家基因缺陷株為受體菌,在質(zhì)粒上克隆入同源或異源完整的受體菌缺陷基因作為外源基因穩(wěn)定表達(dá)的選擇標(biāo)記。王春風(fēng)等利用胸苷酸合成酶thyA基因替代穿梭載體pW425e中的紅霉素抗性基因,得到重組質(zhì)粒pW425t,該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化thyA缺陷的嗜酸乳酸桿菌DOMLaS107后,可以在不含胸苷酸的MRS培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。此外,還有氨基酸缺陷有關(guān)的選擇標(biāo)記。Bron等以丙氨酸消旋酶基因做選擇標(biāo)記,植物乳酸桿菌染色體上含有單一拷貝的丙氨酸消旋酶基因。當(dāng)該基因缺失時(shí)需要在大量的D-丙氨酸上才能生長(zhǎng)。含有異源丙氨酸消旋酶基因的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入缺失丙氨酸消旋酶基因的植物乳酸桿菌中,在不含D-丙氨酸情況下,丙氨酸消旋酶基因就作為選擇標(biāo)記。另外,該質(zhì)粒也可以轉(zhuǎn)化野生型的植物乳酸桿菌中并可以穩(wěn)定存在。4.3lactacinf的轉(zhuǎn)染lafI基因是LactobacillusjohnsoniiVP111088產(chǎn)生的LactacinF的免疫基因。將含有l(wèi)afI基因的質(zhì)粒pTRK434轉(zhuǎn)化入發(fā)酵乳酸桿菌NCD01750,可用加入LactacinF的培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)化子。lafI標(biāo)記片段小、通用性好,可在許多對(duì)LactacinF敏感的乳酸桿菌中使用。此外,嗜酸乳酸桿菌的AciocinA和AciocinB的結(jié)構(gòu)基因和免疫基因已分別在干酪乳酸桿菌與植物乳酸桿菌和發(fā)酵乳酸桿菌中表達(dá),這都給利用細(xì)菌素免疫基因作為食品級(jí)標(biāo)記提供了可能。5乳酸桿菌tge和耐藥目前人們主要利用大腸桿菌作為外源基因的表達(dá)系統(tǒng),但大腸桿菌是潛在的致病菌,且易形成包涵體,不利于外源蛋白的分離和純化。而乳酸桿菌是公認(rèn)安全級(jí)(GRAS)菌,乳酸桿菌作為外源蛋白的表達(dá)載體的最大優(yōu)點(diǎn)是可以口服,而且乳酸桿菌自身及其各種代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體也有營(yíng)養(yǎng)和免疫功能,再加上其攜帶的目的蛋白的專一性作用,集多種功能于一體,這就是目前在微生態(tài)學(xué)領(lǐng)域中提出的多功能微生態(tài)制劑,因此乳酸桿菌食品級(jí)載體的研究與開發(fā)具有相當(dāng)大的潛力和意義。理想的黏膜免疫疫苗可以促進(jìn)抗原和免疫系統(tǒng)之間的有效接觸、刺激體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)、在單劑量免疫以后產(chǎn)生長(zhǎng)期的免疫保護(hù)作用,并且穩(wěn)定、無(wú)毒性。目前研究得最透徹的致弱病原體載體,因其仍可能保持侵襲性和毒性使它們?cè)趹?yīng)用于兒童和免疫力缺陷者時(shí)受到限制。針對(duì)基因工程致弱菌大范圍應(yīng)用而帶來(lái)的安全和環(huán)境問(wèn)題,發(fā)展了以乳酸菌為代表的非致病性革蘭氏陽(yáng)性菌載體。乳酸桿菌的一些菌株具有S層(S-layer),由單一的蛋白亞單位組成規(guī)則排列的類晶格結(jié)構(gòu),與大腸桿菌相比,乳酸桿菌僅有一層細(xì)胞膜,目的蛋白可在S層蛋白信號(hào)肽的引導(dǎo)下直接分泌到細(xì)胞外,從而容易獲得目的蛋白。用乳酸桿菌作為疫苗載體不僅可使口服的乳酸桿菌刺激產(chǎn)生黏膜及全身免疫反應(yīng),提高某些免疫活性因子如IL-2、IFN-α的分泌,而且可將特異性抗原分子攜帶并分泌到腸道,同時(shí)也可穿過(guò)腸壁進(jìn)入黏膜下層,進(jìn)而引起細(xì)胞免疫和體液免疫,因此,乳酸桿菌是一種極有前景的疫苗載體。在“全球健康重大挑戰(zhàn)”計(jì)劃中,有一項(xiàng)“改進(jìn)兒童疫苗,在嬰兒出生后不久即可服用,發(fā)展不需要注射的疫苗接種系統(tǒng)”,這項(xiàng)計(jì)劃展示了未來(lái)疫苗開發(fā)的重點(diǎn)可能是口服疫苗,因此乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研制成功可能會(huì)引起一場(chǎng)免疫學(xué)界的革命。目前,用破傷風(fēng)毒素C片段(TTFC)作模型抗原已獲得許多乳酸桿菌用于免疫接種的知識(shí),并且結(jié)合人們對(duì)免疫系統(tǒng)認(rèn)識(shí)的不斷提高及近來(lái)克隆和表達(dá)技術(shù)的發(fā)展,將能利用TTFC以外的抗原,開辟了乳酸桿菌作為活疫苗載體的真實(shí)前景。MariaLeonorS等構(gòu)建了表達(dá)肺炎鏈球菌表面抗原A乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng),以融合蛋白的形式表達(dá)肺炎鏈球菌表面抗原,獲得較好的實(shí)驗(yàn)效果。在食品級(jí)微生物中,肺炎鏈球菌抗原的表達(dá)為抗此病原開辟了以黏膜免疫接種新途徑;P.S.Ho等經(jīng)胃給藥途徑利用Lactobacilluscasei表達(dá)傳染性胃腸炎病毒(TGEV)刺突狀糖蛋白誘導(dǎo)特異性抗體的研究,口服免疫接種的動(dòng)物獲得了較好的保護(hù)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),外源抗原基因表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面,均能誘發(fā)針對(duì)該抗原的全身和局部黏膜免疫反應(yīng),通過(guò)口服、鼻黏膜或腹腔注射等途徑接種,均可引起有效的免疫應(yīng)答。更有意義的是,法國(guó)和巴西已于2000年聯(lián)手開展在乳酸桿菌中表達(dá)輪狀病毒的抗原基因,然后用重組的乳酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)酸奶,來(lái)預(yù)防兒童輪狀病毒性腹瀉。更深層次的研究,可以將某種抗原基因與其靶位點(diǎn)的靶受體基因融合表達(dá),使抗原基因在體內(nèi)表達(dá)后即可直接到達(dá)靶位點(diǎn)