乳酸桿菌的研究進展

乳酸桿菌的研究進展

蘑菇是人類和動物腸道中非常重要的寄生蟲之一。這種菌是一種雙性厭氧的紅景天菌。這是一家重要的食品和醫(yī)療工程領(lǐng)域微生物，包括三種類型的乳酸菌、乳酸桿菌和雙殼菌。20世紀80年代,人們開始致力于乳酸菌生物學(xué)性質(zhì)和分子機制的研究,乳酸桿菌在農(nóng)業(yè)、食品領(lǐng)域所具有的重大經(jīng)濟意義及對人體和動物健康的重要性,越來越引起人們的關(guān)注。隨著乳酸桿菌分子生物學(xué)的發(fā)展和電轉(zhuǎn)基因技術(shù)的建立,以及各類表達調(diào)控元件的分離和克隆,已經(jīng)建立和發(fā)展了一系列乳酸桿菌基因表達載體和傳遞系統(tǒng),為探索其新的應(yīng)用潛力提供了基礎(chǔ),其中利用乳酸桿菌作為抗原傳遞載體進行粘膜疫苗免疫的研究,是該領(lǐng)域研究的前沿和熱點。本文主要對乳酸桿菌表達系統(tǒng)方面的進展作一綜述。1微生物指標菌乳酸桿菌作為主要的益生菌廣泛應(yīng)用于食品及飼料加工業(yè),在功能食品、醫(yī)療保健、微生態(tài)制劑等領(lǐng)域的應(yīng)用具有誘人的前景。目前,乳酸桿菌制劑已被應(yīng)用于腸道的微生態(tài)治療。乳酸桿菌另一個在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力的是作為免疫接種的疫苗載體。乳酸桿菌作為外源基因表達宿主菌,其優(yōu)越性主要表現(xiàn)在:①乳酸桿菌能在呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)定植,對維持微生態(tài)平衡具有重要作用;②在食品工業(yè)各個領(lǐng)域中長期應(yīng)用已證實不具有致病性,被公認為安全級(GRAS,generallyrecognizedassafe)微生物,身為食品級細菌,易構(gòu)建成食品級的基因克隆及表達系統(tǒng),可以有效提高基因工程產(chǎn)品的安全性,并可在一定程度上簡化表達產(chǎn)物的后期處理工藝;③具有控制腸道感染、增加某些食物的營養(yǎng)價值、控制血清膽固醇水平、改善乳糖代謝、誘導(dǎo)體內(nèi)特異性及非特異性免疫應(yīng)答以及抗腫瘤活性等功能;④同腸胃外免疫途徑相比,通過黏膜免疫,可以誘發(fā)IgA產(chǎn)生;⑤具有免疫佐劑作用、固有免疫原性及對膽汁酸的抵抗力。因此,乳酸桿菌作為基因工程受體菌的應(yīng)用前景十分廣闊。2糖代謝的發(fā)生乳酸桿菌的許多種類中均發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的存在,且多種乳酸桿菌均具有1個或多個質(zhì)粒譜。用DNA-cDNA雜交和核苷酸序列分析證實,各種質(zhì)粒之間具有不同程度的同源性,從而說明質(zhì)粒間的橫向傳遞和重組是相當(dāng)頻繁的。最近幾年開展了有關(guān)質(zhì)粒與細菌特性關(guān)系的研究,發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒與某些表型,如抗藥性、N-乙酰氨基葡萄糖減緩酸的形成、糖苷的代謝、糖代謝、氨基酸代謝、細菌素產(chǎn)生與免疫等密切相關(guān)。大多數(shù)乳酸桿菌質(zhì)粒表現(xiàn)出分離穩(wěn)定性,尤其是小的隱性質(zhì)粒較大質(zhì)粒相對更加穩(wěn)定。經(jīng)研究表明乳酸桿菌質(zhì)粒具有如下特點:①大多數(shù)乳酸桿菌質(zhì)粒均為隱蔽型質(zhì)粒,但已證明某些乳酸桿菌的細菌素、糖代謝有關(guān)的酶及抗生素抗性等都是由不同質(zhì)粒所決定的;②乳酸桿菌質(zhì)粒具有遺傳穩(wěn)定性;③乳酸桿菌中小型質(zhì)粒拷貝數(shù)高,一般可達30~50個;④部分乳酸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子宿主范圍廣泛,可在其他種類的革蘭陽性菌及大腸桿菌中發(fā)揮作用,避免了專一性質(zhì)粒在不同菌株之間使用時不必要的亞克隆;⑤乳酸菌屬的某些菌株的質(zhì)粒也可作為乳酸桿菌的質(zhì)粒,如由宿主范圍廣的乳酸球菌質(zhì)粒pGK12構(gòu)建出的乳酸桿菌基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng);⑥某些乳酸桿菌質(zhì)粒沒有宿主特異性,如pLP501、pLPE323適用于廣泛宿主范圍,可在不同種類乳酸桿菌中增殖,而且它們的擴增拷貝數(shù)沒有明顯不同,這說明其在不同宿主菌中DNA復(fù)制調(diào)控機制是相似的。表1列出了從乳酸桿菌中分離的質(zhì)粒及構(gòu)建的質(zhì)粒。3乳酸桿菌種的誘導(dǎo)表達隨著乳酸桿菌分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的發(fā)展,已分離出了乳酸桿菌的各種表達調(diào)控元件,對乳酸桿菌基因轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控及蛋白質(zhì)分泌機制有了進一步的了解,并通過對部分質(zhì)粒DNA序列的測定,然后同已知序列質(zhì)粒的基因進行比較來推測未知質(zhì)粒基因功能的途徑,相繼開發(fā)出了乳酸桿菌的克隆載體、表達載體、整合載體。研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌質(zhì)粒基因中普遍存在兩種調(diào)控序列,一種是與基因復(fù)制起始相關(guān)的序列,主要包括兩大類:一類是編碼蛋白的開放閱讀框架ORF,在乳酸桿菌中與質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)的ORF之間存在同源性。另一類是與調(diào)控有關(guān)的非編碼序列,主要包括復(fù)制相關(guān)蛋白作用的靶序列、正-負向復(fù)制起始點、缺失位點、啟動子等復(fù)制調(diào)控元件。其中乳酸桿菌的啟動子對LAB具有高度的選擇性,故在LAB表達系統(tǒng)中,很少使用外源啟動子,目前已成功用于表達外源蛋白的啟動子有l(wèi)acA、lacR、lacF、T7、xylA、lacS、nisA/nisZ、nisF、usp等,這些啟動子的誘導(dǎo)物都是食品級的,如乳糖、木糖和Nisin等,易于構(gòu)成食品級LAB表達系統(tǒng),提高轉(zhuǎn)基因LAB工程菌株的安全性;另一種是控制質(zhì)粒拷貝數(shù)和不相容性的DNA序列。質(zhì)粒的拷貝數(shù)是由DNA非編碼序列中的重復(fù)序列和反轉(zhuǎn)錄RNA來控制的。除pLJ1外,所有質(zhì)粒都有與革蘭陽性桿菌質(zhì)粒復(fù)制蛋白(Rep)相似的一種蛋白,根據(jù)復(fù)制蛋白的功能特性,及和其他質(zhì)粒復(fù)制蛋白結(jié)構(gòu)相似性,推測乳酸桿菌屬的小質(zhì)粒是以滾環(huán)(RCR)方式進行復(fù)制的,可產(chǎn)生單股DNA中間體的積累。因此具有滾環(huán)復(fù)制所必需的復(fù)制啟動元件,這些結(jié)構(gòu)包括正-負復(fù)制起始點、復(fù)制控制元件和移動元件等,這些序列或元件與其他源于革蘭氏陽性菌的質(zhì)粒的相應(yīng)區(qū)域的廣泛的同源性,推測乳酸桿菌質(zhì)粒的這些序列或元件是通過基因內(nèi)或基因間傳遞機制而獲得的。4食品級選擇性標記的質(zhì)粒載體傳統(tǒng)的乳酸菌載體都帶有一個或多個編碼特定抗生素(如紅霉素、氯霉素等)抗性的基因,如果將抗生素抗性基因投放到環(huán)境中或人和動物體內(nèi),由于抗性因子的轉(zhuǎn)移,將帶來生物安全性的嚴重后果。為了防止使用抗生素抗性標記所引起的危害,最有效的辦法是用安全的食品級標記替代抗生素抗性標記以建立食品級選擇性標記的載體。因此,食品級乳酸桿菌表達系統(tǒng)成為該領(lǐng)域研究的前沿和熱點,為了開發(fā)適用于人和動物的食品級乳酸桿菌表達載體,研究者尋求構(gòu)建非抗生素標記的質(zhì)粒載體,現(xiàn)在用于乳酸桿菌表達系統(tǒng)的食品級選擇性標記主要有三類:糖類利用標記、營養(yǎng)缺陷型標記、編碼細菌素抗性,這樣構(gòu)建出的乳酸桿菌表達系統(tǒng),載體、受體及誘導(dǎo)物均為食品級,可直接制成口服制劑。所以,食品級的乳酸桿菌工程菌可直接應(yīng)用于食品工業(yè)和醫(yī)藥保健等領(lǐng)域,有著巨大的應(yīng)用前景和潛在的商業(yè)價值。4.1d-木糖發(fā)酵糖類作為選擇標記,主要是利用某種糖僅為少數(shù)乳酸桿菌利用,而其他乳酸桿菌不能利用其為發(fā)酵底物,將能發(fā)酵這種物質(zhì)的乳酸桿菌的基因克隆與乳酸桿菌的質(zhì)粒載體連接,轉(zhuǎn)化不能利用這種物質(zhì)的乳酸桿菌中進行表達,這樣就可通過該物質(zhì)作為底物來篩選。例如乳酸桿菌中有少數(shù)株系可利用D-木糖作為碳源,而且與木糖發(fā)酵有關(guān)的基因也研究得較為清楚。Posno等把可發(fā)酵木糖的戊糖乳酸桿菌MD353染色體上的xyl基因克隆到大腸桿菌-乳酸桿菌穿梭載體pLP3537,得到重組pLP3537-xyl質(zhì)粒,再將其轉(zhuǎn)入不能利用木糖的干酪乳酸桿菌ATCC393中,結(jié)果轉(zhuǎn)化子獲得了可利用木糖的能力,由此得到利用木糖發(fā)酵作為乳酸桿菌食品級選擇標記。另外,Takala等使干酪乳酸桿菌的磷酸化β-牛乳糖酶基因缺失141bp,成為乳糖利用缺陷型,構(gòu)建的質(zhì)粒pLEB600含有來源于干酪乳酸桿菌的lacG基因和鼠李糖乳酸桿菌的lacG基因啟動子。質(zhì)粒pLEB600轉(zhuǎn)化乳糖缺陷型干酪乳酸桿菌后即可互補利用乳糖。lacG基因起到選擇標記的作用。4.2．質(zhì)粒的篩選一類為以細菌管家基因缺陷株為受體菌,在質(zhì)粒上克隆入同源或異源完整的受體菌缺陷基因作為外源基因穩(wěn)定表達的選擇標記。王春風(fēng)等利用胸苷酸合成酶thyA基因替代穿梭載體pW425e中的紅霉素抗性基因,得到重組質(zhì)粒pW425t,該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化thyA缺陷的嗜酸乳酸桿菌DOMLaS107后,可以在不含胸苷酸的MRS培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。此外,還有氨基酸缺陷有關(guān)的選擇標記。Bron等以丙氨酸消旋酶基因做選擇標記,植物乳酸桿菌染色體上含有單一拷貝的丙氨酸消旋酶基因。當(dāng)該基因缺失時需要在大量的D-丙氨酸上才能生長。含有異源丙氨酸消旋酶基因的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入缺失丙氨酸消旋酶基因的植物乳酸桿菌中,在不含D-丙氨酸情況下,丙氨酸消旋酶基因就作為選擇標記。另外,該質(zhì)粒也可以轉(zhuǎn)化野生型的植物乳酸桿菌中并可以穩(wěn)定存在。4.3lactacinf的轉(zhuǎn)染lafI基因是LactobacillusjohnsoniiVP111088產(chǎn)生的LactacinF的免疫基因。將含有l(wèi)afI基因的質(zhì)粒pTRK434轉(zhuǎn)化入發(fā)酵乳酸桿菌NCD01750,可用加入LactacinF的培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)化子。lafI標記片段小、通用性好,可在許多對LactacinF敏感的乳酸桿菌中使用。此外,嗜酸乳酸桿菌的AciocinA和AciocinB的結(jié)構(gòu)基因和免疫基因已分別在干酪乳酸桿菌與植物乳酸桿菌和發(fā)酵乳酸桿菌中表達,這都給利用細菌素免疫基因作為食品級標記提供了可能。5乳酸桿菌tge和耐藥目前人們主要利用大腸桿菌作為外源基因的表達系統(tǒng),但大腸桿菌是潛在的致病菌,且易形成包涵體,不利于外源蛋白的分離和純化。而乳酸桿菌是公認安全級(GRAS)菌,乳酸桿菌作為外源蛋白的表達載體的最大優(yōu)點是可以口服,而且乳酸桿菌自身及其各種代謝產(chǎn)物對機體也有營養(yǎng)和免疫功能,再加上其攜帶的目的蛋白的專一性作用,集多種功能于一體,這就是目前在微生態(tài)學(xué)領(lǐng)域中提出的多功能微生態(tài)制劑,因此乳酸桿菌食品級載體的研究與開發(fā)具有相當(dāng)大的潛力和意義。理想的黏膜免疫疫苗可以促進抗原和免疫系統(tǒng)之間的有效接觸、刺激體液和細胞免疫反應(yīng)、在單劑量免疫以后產(chǎn)生長期的免疫保護作用,并且穩(wěn)定、無毒性。目前研究得最透徹的致弱病原體載體,因其仍可能保持侵襲性和毒性使它們在應(yīng)用于兒童和免疫力缺陷者時受到限制。針對基因工程致弱菌大范圍應(yīng)用而帶來的安全和環(huán)境問題,發(fā)展了以乳酸菌為代表的非致病性革蘭氏陽性菌載體。乳酸桿菌的一些菌株具有S層(S-layer),由單一的蛋白亞單位組成規(guī)則排列的類晶格結(jié)構(gòu),與大腸桿菌相比,乳酸桿菌僅有一層細胞膜,目的蛋白可在S層蛋白信號肽的引導(dǎo)下直接分泌到細胞外,從而容易獲得目的蛋白。用乳酸桿菌作為疫苗載體不僅可使口服的乳酸桿菌刺激產(chǎn)生黏膜及全身免疫反應(yīng),提高某些免疫活性因子如IL-2、IFN-α的分泌,而且可將特異性抗原分子攜帶并分泌到腸道,同時也可穿過腸壁進入黏膜下層,進而引起細胞免疫和體液免疫,因此,乳酸桿菌是一種極有前景的疫苗載體。在“全球健康重大挑戰(zhàn)”計劃中,有一項“改進兒童疫苗,在嬰兒出生后不久即可服用,發(fā)展不需要注射的疫苗接種系統(tǒng)”,這項計劃展示了未來疫苗開發(fā)的重點可能是口服疫苗,因此乳酸桿菌表達系統(tǒng)的研制成功可能會引起一場免疫學(xué)界的革命。目前,用破傷風(fēng)毒素C片段(TTFC)作模型抗原已獲得許多乳酸桿菌用于免疫接種的知識,并且結(jié)合人們對免疫系統(tǒng)認識的不斷提高及近來克隆和表達技術(shù)的發(fā)展,將能利用TTFC以外的抗原,開辟了乳酸桿菌作為活疫苗載體的真實前景。MariaLeonorS等構(gòu)建了表達肺炎鏈球菌表面抗原A乳酸桿菌表達系統(tǒng),以融合蛋白的形式表達肺炎鏈球菌表面抗原,獲得較好的實驗效果。在食品級微生物中,肺炎鏈球菌抗原的表達為抗此病原開辟了以黏膜免疫接種新途徑;P.S.Ho等經(jīng)胃給藥途徑利用Lactobacilluscasei表達傳染性胃腸炎病毒(TGEV)刺突狀糖蛋白誘導(dǎo)特異性抗體的研究,口服免疫接種的動物獲得了較好的保護。實驗發(fā)現(xiàn),外源抗原基因表達于細胞內(nèi)或細胞表面,均能誘發(fā)針對該抗原的全身和局部黏膜免疫反應(yīng),通過口服、鼻黏膜或腹腔注射等途徑接種,均可引起有效的免疫應(yīng)答。更有意義的是,法國和巴西已于2000年聯(lián)手開展在乳酸桿菌中表達輪狀病毒的抗原基因,然后用重組的乳酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)酸奶,來預(yù)防兒童輪狀病毒性腹瀉。更深層次的研究,可以將某種抗原基因與其靶位點的靶受體基因融合表達,使抗原基因在體內(nèi)表達后即可直接到達靶位點