國欣棉3號(hào)幼苗根系活性氧代謝與dpc浸種的互作

國欣棉3號(hào)幼苗根系活性氧代謝與dpc浸種的互作

氨基乙酰胺（dpc）是一種植物生長緩沖劑，其名稱為1.1-甲基二羥氯仿胺（1,1-）。赤霉素的生物合成可以從80年代開始。20世紀(jì)80年代以來，中國和美國等主要的棉花國家廣泛用于控制棉花產(chǎn)量。除了控制徒長,DPC還可促進(jìn)棉花根系和產(chǎn)量器官的發(fā)育,并能增強(qiáng)根系活力、提高根系功能。根系活力主要反映根系生命活動(dòng)的旺盛程度和吸收、合成等功能的強(qiáng)弱程度。已有報(bào)道指出,DPC處理可以提高棉株根系合成氨基酸的能力,增加傷流液的溢泌量,增強(qiáng)對(duì)氮、磷、鉀等礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收。但迄今為止,尚不清楚DPC提高棉花根系活力的生理機(jī)制?；钚匝?ROS)是一類具有氧化能力的分子、離子和自由基,在植物細(xì)胞正常代謝過程中可通過多條途徑產(chǎn)生。ROS一方面可作為信號(hào)分子參與植物生長發(fā)育、細(xì)胞程序化死亡(PCD)和生物及非生物脅迫應(yīng)答等生理過程,另一方面作為強(qiáng)氧化劑具有極高的活性和毒性,會(huì)引起一些大分子物質(zhì)(如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等)的氧化破壞,甚至引起細(xì)胞的死亡。有研究發(fā)現(xiàn),DPC處理可以有效改善植株體內(nèi)的ROS代謝、降低膜脂過氧化作用,從而提高植株的抗旱和耐鹽能力、延緩葉片的衰老。為此我們推測,DPC處理提高棉花根系活力可能與改善根系的ROS代謝有關(guān)。本文的研究目的,一是采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色、吖啶橙染色和非損傷微測(NMT)等方法進(jìn)一步驗(yàn)證DPC浸種提高棉花根系活力的作用,二是探究根系組織中ROS及活性氧清除酶的變化,試圖從ROS代謝的角度揭示DPC浸種提高棉花根系活力的作用機(jī)制。1材料和方法1.1種子萌發(fā)dpc國欣棉3號(hào)由河北國欣種業(yè)有限公司培育并提供;DPC有效成分含量為97.5%,由河北國欣諾農(nóng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)并提供。選取均勻飽滿的種子分別置于清水(對(duì)照)和200mgL–1的DPC溶液中,于28℃下浸泡12h,然后用清水將種子沖洗干凈,于去離子水沖洗過的細(xì)河沙中萌發(fā)。培養(yǎng)室光照/黑暗時(shí)長為12h/12h,溫度為(30±2)℃/(20±2)℃。萌發(fā)5d后子葉展開,小心取出均勻一致的幼苗進(jìn)行測定。1.2生理指標(biāo)及分析方法根系活力用氯化三苯基四氮唑(TTC)比色法測定根系的還原能力。根尖TTC染色及觀察,用雙面刀片切下2~3cm長的根尖,迅速浸入含0.6%TTC的磷酸緩沖液(50mmolL–1,pH7.4),在30℃下避光染色24h,然后將樣品轉(zhuǎn)入55℃的95%酒精溫育2h,取出吸干水分后在顯微鏡(BH-2,Olympus,Tokyo)下觀察并照相。K+的凈流速測定,在旭月(北京)科技有限公司采用非損傷微測技術(shù)(NMT,BIO-001B,YoungerUSASci.&Tech.Corp.,Amherst,MA,USA)測定整株幼苗根尖部位的K+流速。用蒸餾水沖洗干凈幼苗根系并在其中浸泡15min,轉(zhuǎn)入20mL測試液中平衡10min,再轉(zhuǎn)入新的20mL測試液中開始測試。測試液配方為0.1mmolL–1KCl、0.1mmolL–1CaCl2、0.3mmolL–1MES,pH6.0;為避免引入Na+和K+,用低濃度Tris和HCl調(diào)節(jié)測試液pH值。每處理測定4株幼苗,測試部位距根尖300μm,即根系分生區(qū);測試持續(xù)7~10min,計(jì)算時(shí)舍棄前2~3min的數(shù)據(jù)。吖啶橙染色參考ünal和Uyanikgil的方法,將離體幼苗根系插入含有0.05mgmL–1吖啶橙的磷酸緩沖液(10mmolL–1,pH7.0),在室溫下避光染色30min,然后取出用10mmolL–1磷酸緩沖液沖洗3次,吸干水分后在激光共聚焦顯微鏡(SP5,Leica,Germany)下觀察并照相。呼吸速率應(yīng)用紅外線CO2分析儀(CIRAS-2portableIRGAsystem,PP-systems,Amesbury,MA,USA)測定。相對(duì)電導(dǎo)率參考Nayyar等的方法,應(yīng)用電導(dǎo)儀(EC215,HannaInstruments,USA)測定。抗氧化酶活性及其同工酶染色參照Gossett等的方法,酶提取液為50mmolL–1磷酸緩沖液[pH7.0,含1%(w/v)PVP、0.1mmolL–1EDTA-Na2和0.05%(w/v)TritonX-100]。取0.5g新鮮的幼苗根尖(2~3cm長),冰浴條件下研磨成勻漿,然后在4℃下12000uf0b4g離心15min,取上清液待測。超氧化物歧化酶(SOD,EC1.15.1.1)、過氧化物酶(POD,EC1.11.1.7)、過氧化氫酶(CAT,EC1.11.1.6)、抗壞血酸氧化酶(APX,EC1.11.1.11)和谷胱甘肽還原酶(GR,EC1.6.4.2)等抗氧化酶活性的測定、同工酶分離和染色均采用Parida等的方法。H2O2活體組織原位檢測參照Romreo-Puertas等的方法,將離體幼苗根系插入含1%3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)的磷酸緩沖液(10mmolL–1,pH6.5),室溫下避光吸收8h,取出吸干水分后在顯微鏡(BH-2,Olympus,Tokyo)下觀察并照相。H2O2含量和超氧陰離子(O2–)生成速率,取0.5g新鮮幼苗根尖(2~3cm長),在冰浴中用100mmolL–1磷酸緩沖液(pH7.8,含1%PVP)研磨成勻漿,于4℃下12000uf0b4g離心20min,取上清液測定H2O2含量和O2–生成速率。1.3統(tǒng)計(jì)量的分析所有試驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次,各次結(jié)果趨勢一致,取其中具有代表性的數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用SPASS16.0(SPSSInc.Chicago,USA)的t檢驗(yàn)對(duì)平均值進(jìn)行比較(P<0.05)。2結(jié)果與分析2.1根充質(zhì)原料的生理特征TTC是一種水溶性物質(zhì),通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被脫氫輔酶(NADH或NADPH)還原變成紅色,常用來表征根系活力。從圖1可知,DPC浸種根系的TTC染色較對(duì)照深,單位面積光密度為對(duì)照的1.3倍(P<0.05)。此外,以TTC法測定的根系活力為108.4μgg–1h–1,較對(duì)照的40.6μgg–1h–1提高了167%(P<0.05)。DPC浸種處理使棉花幼苗根尖部位(2~3cm)的呼吸速率顯著提高90%(圖2-A),表明根系生命活動(dòng)比較旺盛。根系分生區(qū)的吸收能力也得以增強(qiáng),K+凈內(nèi)流速率由對(duì)照的–292.85pmolcm–2s–1顯著增加到–399.30pmolcm–2s–1(負(fù)值表示內(nèi)流,即吸收;圖2-B),提高幅度為36%(P<0.05)。此外,DPC浸種處理根尖部位(2~3cm)的相對(duì)電導(dǎo)率由對(duì)照的64%降低到56%,提示其根系細(xì)胞膜完整性好、透性低。吖啶橙具有膜通透性,可使細(xì)胞中的DNA和RNA染色,與DNA結(jié)合時(shí)細(xì)胞核發(fā)出均勻的綠色或黃綠色熒光,與RNA結(jié)合時(shí)細(xì)胞質(zhì)發(fā)出均勻的桔黃色或桔紅色熒光。在凋亡的細(xì)胞中,染色質(zhì)固縮或斷裂為大小不等的片段,吖啶橙會(huì)使其染上致密濃染的綠色熒光。比較圖3可知,DPC處理根系細(xì)胞的桔紅色著色較對(duì)照均勻,熒光亮度也比較高(光密度為對(duì)照的2.3倍),表明其細(xì)胞狀態(tài)正常、細(xì)胞活力較高。從圖3中可見,對(duì)照根系伸長區(qū)的部分細(xì)胞中出現(xiàn)致密濃染的綠色熒光斑點(diǎn)(a區(qū)),提示該區(qū)發(fā)生了細(xì)胞凋亡,而DPC浸種根系的相應(yīng)區(qū)域未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。本試驗(yàn)中根系細(xì)胞胞壁的綠色熒光比較強(qiáng),是因?yàn)槠渲械哪举|(zhì)素也可被吖啶橙染成綠色。2.2dpc播種對(duì)pod活性和同工酶表達(dá)的影響DPC浸種處理的根系SOD活力較對(duì)照顯著降低22%(表1),7條同工酶帶的表達(dá)量也降低(圖4),其中自上而下第2、第6、第7條酶帶的光密度分別為對(duì)照的71%、53%和70%。與之相反,浸種處理的CAT、APX和GR活力分別較對(duì)照顯著增加32%、67%和51%,CAT和APX同工酶帶的光密度也分別較對(duì)照提高90%和70%(圖4),GR自上而下第1、第4、第5條同工酶帶的光密度則分別較對(duì)照提高40%、80%和50%(圖4)。DPC浸種處理對(duì)POD活力和同工酶表達(dá)量均無顯著影響(表1和圖4)。DAB是過氧化物酶的生色底物,在H2O2存在下失去電子而形成褐色沉淀。由圖5可見,DPC浸種處理根系染色較淺且染色面積較小,染色光密度僅為對(duì)照的23%?；瘜W(xué)測定結(jié)果也顯示DPC浸種處理使根系中的H2O2含量較對(duì)照降低了56%(圖6)。此外,處理根系的O2–產(chǎn)生速率也較對(duì)照降低65%(圖6)。3dpc與其他保鮮措施的相互作用根系活力泛指根系的吸收、合成及氧化和還原能力。本文結(jié)果表明,DPC浸種處理根系的還原能力(TTC法)增強(qiáng)(圖1),呼吸速率提高(圖2-A),凋亡細(xì)胞減少(圖3),K+凈內(nèi)流速率提高(圖2-B),這為DPC處理增強(qiáng)棉花根系活力提供了更多的證據(jù)。本文還發(fā)現(xiàn),DPC浸種處理顯著提高了CAT、APX和GR的活力及同工酶表達(dá)量,但降低了SOD的活力及其同工酶表達(dá)量。已有研究表明,SOD催化植物組織中的O2–生成H2O2,而CAT、APX和GR可將H2O2進(jìn)一步分解為無毒害作用的H2O和O2。作者推測,DPC浸種處理既可減少幼苗根系H2O2的生成,又可加速H2O2的降解,因此顯著降低了根系中H2O2的含量(圖6)及其DAB染色強(qiáng)度(圖5)。也有報(bào)道指出,DPC影響植株體內(nèi)活性氧清除酶的活性,可以促進(jìn)ROS的清除、維護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定、延緩葉片的衰老、提高植株的耐鹽能力等。O2–的產(chǎn)生源于電子傳遞鏈運(yùn)行時(shí)電子的漏出,漏出的電子直接與O2進(jìn)行單電子還原形成O2–,對(duì)細(xì)胞具有高毒性。本研究中,DPC浸種處理根系的O2–產(chǎn)生速率顯著低于對(duì)照(圖6),可能是因?yàn)樘幚砀递^高的呼吸速率(圖2-A)和/或較強(qiáng)的還原能力(圖1)減少了電子傳遞鏈的電子漏出。以往研究證明,ROS能改變細(xì)胞內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài),UV-B輻射誘導(dǎo)的ROS積累可以抑制NADPH硝酸還原酶的活性。Desikan等報(bào)道,外源H2O2可以激發(fā)擬南芥懸浮細(xì)胞中與細(xì)胞程序化死亡(PCD)有關(guān)的mRNA和蛋白質(zhì)合成,H2O2濃度越高,細(xì)胞死亡的速度越快。Storey和Walker和馬懷宇等的研究也表明,脅迫條件下果樹產(chǎn)生大量ROS,從而誘導(dǎo)根系細(xì)胞死亡,加速根尖木栓化。此外,ROS能激活膜上的非選擇性陽離子通道和部分外排的離子通道,促進(jìn)K+的外排、降低根系細(xì)胞的凈吸收能力。因此作者推測,本試驗(yàn)中D