糖尿病大鼠全腦缺血再灌注后海馬區(qū)磷酸化ku70的表達

糖尿病大鼠全腦缺血再灌注后海馬區(qū)磷酸化ku70的表達

據(jù)報道，高血壓可以加劇腦損傷，這是腦損傷發(fā)病率和死亡率增加的重要獨立危險因素。糖尿病患者中風發(fā)病率明顯高于非糖尿病患者,且腦損害的嚴重程度、中風死亡的可能性均增加,預后較差。有關糖尿病加重腦缺血損傷的機制尚未明確。腦缺血損傷時,腦內(nèi)異常代謝可造成神經(jīng)細胞DNA損傷,受損DNA可通過DNA修復酶進行修復,提高神經(jīng)元的缺血耐受能力,但如果DNA修復功能減弱,則會導致基因突變,細胞發(fā)生死亡。Ku70蛋白是細胞修復DNA依賴蛋白激酶(DNAdependentproteinkinase,DNA-PK)的調(diào)節(jié)亞單位,主要參與DNA雙鏈斷裂的修復,并起到增加DNA修復效率和修復正確性的作用。本研究應用糖尿病聯(lián)合腦缺血再灌注模型,觀察實驗大鼠海馬區(qū)Ku70表達變化以及神經(jīng)細胞凋亡情況,初步探討Ku70與糖尿病加重腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷的關系,為臨床糖尿病并發(fā)缺血缺氧性疾病的防治提供實驗依據(jù)。1材料和方法1.1免疫組化試劑多克隆Ku70抗體和內(nèi)參β-actin(SantaCruz公司);多克隆磷酸化Ku70免疫組化試劑盒(中杉生物有限公司,北京);TUNEL試劑盒(SantaCruz公司,美國);透射電鏡H-7650型(日本);圖像采集及圖像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad生物儀器設備公司)。1.2大鼠全腦缺血模型的制作120只健康雄性SD大鼠由北京維通利華實驗動物中心提供(SCXK(京)2005-0013),體重(185±19)g。隨機分為假手術(shù)組(shamoperation)和血糖正常全腦缺血再灌注組(normoglycemiaglobalcerebralischemia-reperfusion)及糖尿病全腦缺血再灌注組(diabeticcerebralischemia)。血糖正常全腦缺血再灌注組采用改良的Pulsineli4血管阻斷(4-VO)法制作大鼠全腦缺血模型。水合氯醛(350mg/kg)麻醉動物,切開頸正中,分離雙側(cè)頸總動脈,置線頸總動脈下方備用。枕后部沿正中切開,暴露雙側(cè)第1頸椎橫突翼孔,椎動脈行于其下方,直視下電凝椎動脈,使翼小孔后雙側(cè)椎動脈完全閉塞,每次電凝時間約2～4s。術(shù)后大鼠縫皮回籠,24h后以無創(chuàng)性微動脈夾同時夾閉雙側(cè)頸總動脈30min,之后松開進行再灌注。缺血及再灌注期間用紅外線測溫儀監(jiān)測耳內(nèi)鼓膜溫度,并維持在(37±0.2)℃。假手術(shù)組只進行分離暴露血管處理,但不電凝椎動脈、不夾閉頸總動脈。糖尿病全腦缺血再灌注組:大鼠術(shù)前禁食12h,按55mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ),72h后空腹血糖超過16.7mmol/L,有多尿、體重下降等表現(xiàn)的大鼠為糖尿病造模成功。然后按上述全腦缺血模型進行手術(shù),制作糖尿病全腦缺血再灌注模型。每組又隨機分為缺血再灌注1、6、24、48h時間組,各時間點n=10。分別進行以下檢測。1.3海馬組織病理學染色各組各時間取2只動物,動物常規(guī)麻醉,混合固定液(25mL/L戊二醛和20g/L多聚甲醛的磷酸緩沖液)心臟灌注30min,斷頭取海馬組織切成約1mm×1mm×1mm組織塊,立即放入40mL/L戊二醛固定3～4h,0.1mol/L二甲砷酸緩沖液沖洗2遍,再經(jīng)10g/L四氧化鋨固定,緩沖液沖洗,逐級丙酮脫水,環(huán)氧樹脂浸透、包埋、超薄切片后,用醋酸鈾枸櫞酸鉛進行雙重染色。透射電鏡觀察腦細胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化并攝片。1.4免疫組化法檢測海馬組織中的陽性細胞各時間點處死4只動物,40g/L多聚甲醛行心臟灌流,斷頭取腦,在視交叉后1～6mm處冠狀面切開,取中間塊入40g/L多聚甲醛固定液固定,石蠟包埋,切片(片厚5μm)。切片常規(guī)脫蠟至無水,枸櫞酸鹽微波修復,滴加Ku70抗體(1∶200),置濕盒內(nèi)4℃冰箱過夜,PBS沖洗3次,5min/次,切片上滴加IgG抗體-HRP多聚體(PV二步法),置濕盒內(nèi)37℃溫箱30min,PBS沖洗3次,DAB顯色、脫水、透明、封片。陽性率的定量分析:每個標本取5張切片,200倍光鏡下每張切片在海馬隨機選取5個視野,在有測微尺的光學顯微鏡(×200)下,應用Motic-6.0圖像采集及分析系統(tǒng),分別觀察海馬區(qū)陽性細胞變化并計數(shù)陽性細胞數(shù)量。各時間點處死4只動物,快速于冰上剝離海馬組織,稱量0.6g,加入裂解液,冰浴中勻漿,4℃離心5min,3000r/min,取上清,考馬斯亮藍法蛋白質(zhì)定量,樣品制備,轉(zhuǎn)膜、加入抗體(Ku70,1∶2000;β-actin,1∶2000)、室溫孵育2～3h,加入二抗、封閉,ECL顯色。Bio-Rad系統(tǒng)進行吸光度測定,以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的平均吸光度的比值表示蛋白水平,進行半定量分析。1.5dab吸光度切片常規(guī)脫蠟至水,滴加蛋白酶K濕盒中37℃孵育30min,滴加TUNEL混合溶液,50μL/片,濕盒中37℃孵育60min,滴加轉(zhuǎn)化劑AP,50μL/片,濕盒中37℃孵育30min,DAB顯色、脫水、透明、封片。陽性率的定量分析:每個標本取5張切片,每張切片在海馬隨機選取5個視野,在有測微尺的光學顯微鏡(×200)下,應用Motic-6.0圖像采集及分析系統(tǒng)分別觀察海馬區(qū)陽性細胞變化并計數(shù)陽性細胞數(shù)量,取均值。1.6術(shù)后大鼠評分情況由2位參與實驗的人員分別以單盲法對48h時間點實驗動物進行評分和記錄,然后將2組的均值作為最后得分。運動功能:開放場地活動檢測由實驗者將老鼠放入空曠開放場地,按照生理反應正常大鼠應該貼屋里四面墻壁行走,術(shù)后大鼠分無活動、移動但不貼墻壁、貼墻走1～2側(cè)墻壁、貼墻能走3～4側(cè)墻壁4個等級;肢體平衡性檢測將大鼠放于平地上,觀察肢體運動,分左前肢無運動、稍運動、不規(guī)則運動、對稱性伸展4個等級;篩網(wǎng)攀爬檢測將篩網(wǎng)懸空固定,協(xié)助大鼠抓住篩網(wǎng),松手觀察,分抓不住、抓握小于4s、抓握不移動、移動穿越4個等級;平衡性檢測將木桿懸空固定,大鼠置于木桿上,分掉落小于2s、掉落大于2s、抓木桿不移動、移動穿越木桿4個等級。分別給予0～3分。感覺功能:本體感覺檢測分無旋頭反應、不對稱旋轉(zhuǎn)、對稱旋轉(zhuǎn)3個等級;觸須檢測分為無反應、頭不對稱旋轉(zhuǎn)、對稱旋轉(zhuǎn);觸頸檢測分為無反應、退縮遲緩、立即退縮。分別給予1～3分。1.7觀察指標及方差分析應用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)處理,TUNEL陽性細胞以及Ku70指標的組間比較采用析因設計資料方差分析方法,神經(jīng)功能評分的各組間比較采用單因素方差分析,數(shù)據(jù)以均值±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1糖正常腦缺血再灌注組各時間點胞核電子密度及損傷的情況假手術(shù)組中神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常,細胞核規(guī)則,核仁清晰,核質(zhì)均勻散在,核膜光滑,邊緣清晰。神經(jīng)細胞軸索、微管正常;軸索結(jié)構(gòu)排列正常。血糖正常腦缺血再灌注組各時間點可見神經(jīng)細胞不同程度固縮,胞核電子密度增高,核膜凹陷或斷裂,軸索排列紊亂、腫脹,髓鞘泡鼓、內(nèi)折及分層,軸索變性、斷裂等,以24、48h損傷最嚴重。糖尿病腦缺血再灌注組中神經(jīng)元細胞損傷進一步加重,染色質(zhì)聚集明顯,基質(zhì)出現(xiàn)大量空泡,核膜模糊、斷裂,細胞器數(shù)量減少,僅見極少量細胞器,髓鞘嚴重分層,一些部位出現(xiàn)斷裂,以24、48h損傷最為嚴重(圖1)。2.2兩組各時間tunel陽性細胞的表達情況比較凋亡神經(jīng)細胞表現(xiàn)胞核固縮呈棕黃色。假手術(shù)組海馬區(qū)只有極少數(shù)陽性細胞。與假手術(shù)組比較,血糖正常全腦缺血再灌注組各時間TUNEL陽性細胞均增多,48h達高峰(P<0.05);與血糖正常全腦缺血再灌注組比較,糖尿病全腦缺血再灌注組中各時間點TUNEL陽性細胞陽性細胞增多,48h達高峰(P<0.05,圖2、表1)。2.3糖尿病全腦缺血再灌注后ku70表達變化免疫組化檢測Ku70陽性表達主要位于細胞核,陽性細胞的胞質(zhì)可見細小的棕黃色顆粒。假手術(shù)組可見一定量Ku70陽性細胞。與假手術(shù)組比較,血糖正常全腦缺血再灌注組1、6h時間點Ku70陽性細胞增多,24、48h迅速下降;與血糖正常全腦缺血再灌注比較,糖尿病全腦缺血再灌注組中各時間點Ku70陽性細胞減少。免疫印跡檢測結(jié)果顯示Ku70條帶清晰,以β-actin的吸光度值作為內(nèi)參照,對各組條帶的吸光度值進行校正和半定量分析。與假手術(shù)組比較,血糖正常全腦缺血再灌注組中Ku70蛋白水平在1、6h時間點上調(diào),24、48h迅速降低(P<0.05);與血糖正常全腦缺血再灌注組比較,糖尿病全腦缺血再灌注組中Ku70蛋白水平各時間點持續(xù)減少(P<0.05,圖3、圖4、圖5)。說明糖尿病可加重全腦缺血導致的Ku70蛋白減少。2.4假手術(shù)組與假手術(shù)組治療前后血壓比較血糖正常全腦缺血再灌注組動物運動和感覺功能評分(7.64±1.21,6.64±0.65)低于假手術(shù)組(11.71±0.47,8.75±0.44);與血糖正常全腦缺血再灌注組比較,糖尿病全腦缺血再灌注組(4.79±0.93,4.42±0.72)運動及感覺功能評分進一步降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3糖脂質(zhì)蛋白及金屬酶激活FARROKHNIA在局灶性腦缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn),缺血再灌24h,高血糖大鼠較正常血糖組出現(xiàn)了更為明顯的腦組織損傷、梗死面積的擴大;馬軼采用雙血管阻塞聯(lián)合放血法建立大鼠全腦缺血模型,利用TUNEL染色發(fā)現(xiàn)糖尿病鼠在急性期(缺血再灌注1、3h)凋亡神經(jīng)細胞數(shù)量明顯高于正常血糖腦缺血組。本研究結(jié)果顯示糖尿病腦缺血組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)破壞程度、凋亡神經(jīng)細胞數(shù)量以及神經(jīng)功能損害程度均明顯高于血糖正常腦缺血再灌注組,尤其在24h損傷更明顯。提示糖尿病可加重腦缺血管疾病發(fā)病后的病理損傷。但糖尿病增加腦缺血后神經(jīng)細胞死亡的機制尚未明確。Ku70是哺乳動物中修復DNA斷裂雙鏈修復酶的調(diào)節(jié)亞單位,DNA損傷時,Ku70首先與損傷DNA結(jié)合,激活DNA修復酶而啟動整個修復過程,同時增加DNA損傷修復的正確性。SHACKELFORD等研究發(fā)現(xiàn),兔脊髓短暫缺血再灌注引起的可逆性神經(jīng)損傷伴有Ku蛋白結(jié)合DNA活性的升高;而嚴重的缺血再灌注導致永久性的神經(jīng)缺損時Ku蛋白結(jié)合DNA的活性降低。電刺激預處理可上調(diào)局灶腦缺血模型中Ku70的表達,增強DNA修復能力,發(fā)揮其內(nèi)源性神經(jīng)保護作用,減輕腦缺血再灌注損傷。本研究中血糖正常腦缺血組1、6hKu70陽性細胞及表達增加,24、48h迅速減少,神經(jīng)細胞凋亡在6h開始大量出現(xiàn)。推測在腦缺血早期,腦內(nèi)異常代謝引起DNA損傷時,應激引起Ku70短暫增加,增強細胞修復能力,因而大部分細胞處于存活狀態(tài),隨缺血時間的延長,Ku70下降,修復酶的修復功能減退,導致大量細胞壞死或凋亡。本研究結(jié)果顯示,與血糖正常腦缺血組比較,糖尿病腦缺血組Ku70在1h即開始明顯減少,未出現(xiàn)一過性增高現(xiàn)象,持續(xù)減少至48h,各時間凋亡神經(jīng)細胞數(shù)量進一步增加,表明Ku70蛋白減少全面貫穿糖尿病腦缺血再灌注病理進程,是糖尿病增加腦缺血后神經(jīng)細胞丟