2型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建

2型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建

現(xiàn)代生活方式提高了糖尿病發(fā)病率，是嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生健康的一個重要問題。胰島素分泌不足或和胰島素抵抗（r）是糖尿?。╬m）的病理基礎(chǔ)。復(fù)制DM動物模型可以了解DM發(fā)病因素、病理過程和臨床特征。本研究在高脂食物喂養(yǎng)大鼠誘導(dǎo)胰島素抵抗的基礎(chǔ)上,聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(STZ)重復(fù)腹腔注射復(fù)制出類似于人類2型糖尿病(T2DM)大鼠模型。1實(shí)驗(yàn)動物與儀器1.1材料鏈脲佐菌素(STZ,美國Sigma公司);pH=4.2的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液;飼料由鄭州牧專實(shí)驗(yàn)動物中心飼料廠提供,普通飼料(糖/脂肪/蛋白質(zhì)/其他重量構(gòu)成比=54/4/19/23;糖/脂肪/蛋白質(zhì)熱價構(gòu)成比=62.65/11.56/25.79,熱價=13.50kJ/g),高脂飼料(糖/脂肪/蛋白質(zhì)/其他重量構(gòu)成比=32/29/16/23,糖/脂肪/蛋白質(zhì)熱價構(gòu)成比=26.02/58.76/15.22,熱價=19.25kJ/g),喂養(yǎng)前一周臨時配制,低溫保存。1.2動物和分組6周齡Wistar雄性大鼠30只,河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(豫)2005-0001,體重140~160g,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周;測血糖均在3.5~6.0mmol/L,采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計,將大鼠分為A、B和C3組,每組10只。1.3動物喂養(yǎng)A組、B組普通飼料喂養(yǎng),C組高脂飼料喂養(yǎng),由專人管理,自由進(jìn)食、飲滅菌自來水,屏障溫度20~26℃,屏障相對濕度40%~60%,明暗周期各12h。飼養(yǎng)4周后,測定體重、血糖、血漿胰島素、血三酰甘油和膽固醇等指標(biāo)。1.4小劑量STZ多次腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病飼養(yǎng)4周后將B組和C組左下腹腔注射STZ,用量30mg/(kg·d);A組注射枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液,注射液溫度4℃。B、C組STZ連續(xù)用藥3d后,測血糖,對空腹血糖(fastingplasmaglucose,FPG)<7.8mmol/L者,再續(xù)用藥3d,于期滿次日進(jìn)行血糖、血胰島素測定。1.5檢測儀器和項目葡萄糖氧化酶法測血糖,邁瑞B(yǎng)S-300全自動生化分析儀測量血脂譜;Roche全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測血胰島素。采用HOMA法評價胰島素抵抗,HOMA-IR=FINS(μU/ml)×FPG(mmol/L)/22.5。1.6統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)采用xˉ±sxˉ±s表示,對非正態(tài)分布資料進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換,使其成為正態(tài)或偏正態(tài)分布后進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),組間比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計方差分析和重復(fù)測量資料方差分析,自身前后比較采用配對t檢驗(yàn),以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。2結(jié)果2.1各組不同養(yǎng)4周后c組體重的比較分組前,3組大鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),分組喂養(yǎng)4周后,C組體重較A、B組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),A、B兩組之間的體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,表1)。B、C組注射STZ后,出現(xiàn)多飲、多食癥狀,A組飲水及飲食量無明顯增長。2.2兩組高密度膽固醇和低密度膽固醇含量比較分組前,3組間血脂水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。分組喂養(yǎng)4周后,C組三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)水平高于A、B組(P<0.05),與本組分組喂養(yǎng)前比較,C組高密度脂蛋白(HDL)水平有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表2)。2.3各組大鼠fpg、fins和homa-ir的比較分組喂養(yǎng)4周后,處理因素對空腹胰島素(fastinginsulin,FINS)和HOMA-IR有顯著影響,C組FINS水平和IR顯著高于A、B組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示高脂喂養(yǎng)可誘發(fā)高胰島素血癥和胰島素抵抗,而分組因素對FPG、FINS和HOMA-IR的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,表3、4)。2.4兩組a、c兩組患者的統(tǒng)計學(xué)分析B、C兩組注射STZ后FPG水平升高,兩組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但均顯著高于A組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表5。2.5不同處理方式血糖水平各指標(biāo)時點(diǎn)的互動關(guān)系20%葡萄糖10ml灌胃,分別于灌胃前、后30、60、90和120min測血糖值,重復(fù)測量方差分析顯示:不同處理方式血糖水平不同,血糖值依次A組<B組<C組,不同時間點(diǎn)血糖水平值不同,處理和時間存在交互作用,3組血糖變化幅度存在顯著差異。血糖曲線下面積(AUC)按照四邊形數(shù)學(xué)模型計算,即AUC=FPG/2+30min血糖+60min血糖+90min血糖+120min血糖/2。AUC依次是A組<B組<C組(P<0.01),表6、7。3糖尿病患者胰島素抵抗的影響自從Minkowshi等首次用切除狗胰腺的方法建立1型糖尿病(T1DM)動物模型以來,目前已有多種糖尿病動物模型可供選擇。但尚無一種公認(rèn)最理想的造模方法,動物模型的施加因素多種多樣,缺乏統(tǒng)一的操作規(guī)范,評價動物模型方法和標(biāo)準(zhǔn)參差不齊。單純切除胰腺或用藥物選擇性損傷胰腺β-細(xì)胞,導(dǎo)致血胰島素不足而血糖升高造模為T1DM模型,不完全吻合于T2DM的發(fā)病機(jī)制與病理生理特點(diǎn),其研究價值有一定局限性。進(jìn)一步研究糖尿病動物模型制作和評估方法必將對T2DM的病因?qū)W、發(fā)病機(jī)制研究以及防治方法的改進(jìn)起到積極作用。本實(shí)驗(yàn)顯示:C組高脂飼料喂養(yǎng)4周后,血脂譜明顯升高,胰島素抵抗指數(shù)顯著高于喂養(yǎng)前和普通飼料喂養(yǎng)的對照組,提示高脂飲食是誘導(dǎo)胰島素抵抗的重要因素,其機(jī)制可能是通過提高三酰甘油和游離脂肪酸(FFA)水平而實(shí)現(xiàn)的。FFA通過脂肪酸循環(huán)、胰島素信號傳導(dǎo)等多個途徑,下調(diào)外周組織胰島素受體,使受體與胰島素的親和力下降。一旦機(jī)體IR,胰島β細(xì)胞便適應(yīng)性分泌增加以維持血糖水平的相對恒定狀態(tài),出現(xiàn)高胰島素血癥,糖耐量低減或正常,此時如果胰島β細(xì)胞被破壞,血糖便迅速升高而成為典型的T2DM。普通飼料喂養(yǎng)的B組注射STZ后血糖水平雖顯著升高,但仍然低于C組,說明STZ僅僅是對胰島細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,并不增加胰島素抵抗,進(jìn)一步佐證了高脂喂養(yǎng)可誘導(dǎo)胰島素抵抗的效果。本實(shí)驗(yàn)在普通飼料喂養(yǎng)后利用鏈佐菌素小劑量分次注射的方法建立了與人類1型糖尿病表現(xiàn)相似的動物模型(B組)。在高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)胰島素抵抗基礎(chǔ)上再小劑量分次注射給藥,改變胰島內(nèi)分泌細(xì)胞功能,則建立了與人類T2DM表現(xiàn)相似的動物模型(C組),血糖均達(dá)到了DM模型遴選標(biāo)準(zhǔn),建模過程與糖尿病患者的代謝特點(diǎn)比較接近。該模型具有血脂譜異常,IR、高血糖、糖耐量低減,多飲、多尿、多食等特點(diǎn),基本與人類T2DM的癥狀體征、生化指標(biāo)相同,為糖尿病的基礎(chǔ)研究提供了理想模型。本研究用STZ作為造模的藥物,該藥物對胰島細(xì)胞具有高度選擇的毒性作用,而對組織的毒性相對較小,造模方法簡單,成功率高,重復(fù)性好,模型穩(wěn)定,復(fù)制前不需禁食,克服了以往四氧嘧啶造模對肝腎損害較大,不利于糖尿病并發(fā)癥觀察的缺點(diǎn)。不足之處是STZ價格較四氧嘧啶高。糖尿病成模效果的評價方法是造模研究的重要內(nèi)容,其中IR和OGTT是最為常用的評價方法。正常血糖-高胰島素鉗夾技術(shù)是目前評價體內(nèi)IR的金標(biāo)準(zhǔn),然而該試驗(yàn)費(fèi)時費(fèi)力,HOMA-IR法評價胰島素抵抗與金標(biāo)準(zhǔn)明顯相關(guān)性,該法評價胰島素抵抗更優(yōu)于其他簡單的測試方法,尤其適合于動物模