四川農業(yè)大學研究生高級生物化學實驗報告

實驗一蛋白質相對分子質量的測定-凝膠層析法姓名：學號：專業(yè)：一、原理凝膠層析法(即凝膠過濾法，gelfiltration)是根據生物分子大小不同而將其別離開的一種方法，又稱為分子篩層析(molecularsievechromatography)、排阻層析(exclusionchromate--graphy)。凝膠本身具有一種網狀結構(即分子篩)，它可以把生物分子按大小不同進行別離，好似過篩可以把大顆粒與小顆粒分開一樣。但這種“過篩〞與普通的過篩不一樣。將凝膠顆粒在適宜溶劑中浸泡，使充分吸液膨脹，然后裝入層析柱中，參加欲別離的混合物后，再以同一溶劑洗脫。在洗脫過程?。蠓肿佑捎谥睆酱笥谀z孔徑，所以不能進入凝膠內部而沿凝膠顆粒問的空隙最先流出柱外，而小分子可以進入凝膠內部，流速緩慢，以致最后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質得到別離。凝膠是由膠體溶液凝結而成的固體物質，不管是天然凝膠還是人工合成凝膠，他們的內部都有很微細的多孔網狀結構。凝膠層析法常用的天然凝膠是瓊脂糖凝膠〔agarosegel，商品名Sepharose〕，人工合成的凝膠是聚丙烯酰胺凝膠(商品名Bio-gel-P)和葡聚糖凝膠(SephadexG)，后者的商品名為Sephadex型的各種交聯(lián)葡聚糖凝膠，它具有不同孔隙度的立體網狀結構的凝膠，不溶于水。這種聚合物的立體網狀結構，其孔隙大小與被別離物質分子的大小有相應的數(shù)量級。在凝膠充分溶脹后，交聯(lián)度高，空隙小，只有相應的小分子可以通過，適于別離小分子物質。相反，交聯(lián)度低的空隙大，適于別離大分子物質。利用這種物質可別離不同分子量的物質。以下進一步說明其原理。將凝膠裝柱后，柱床體積稱為“總體積〞，以Vt表示，實質上Vt是由V0，Vi與Vg三局部組成，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vi為內體積，Vg為凝膠本身的體積，Vo為“孔隙體積〞或“外體積〞又稱“外水體積〞。洗脫體積(Ve，elutionvolume)與Vo及Vi之間的關系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve為洗脫體積，自參加樣品時算起，到組分最大濃度(峰)出現(xiàn)時所流出的體積；Kd為樣品組分在二相間的分配系數(shù)，也可以說Kd是分子量不同的溶質在凝膠內部和外部的分配系數(shù)。它只與被別離物質分子的大小和凝膠顆?？紫兜拇笮》植加嘘P，而與柱的長短粗細無關，也就是說它對每一物質為常數(shù)，與柱的物理條件無關。Kd可通過實驗求得，上式可改寫成：Kd=〔Ve-Vo〕/Vi上式中Ve為實際測得的洗脫體積；Vo可用不被凝膠滯留的大分子物質的溶液(最好有顏色以便于觀察，如血紅蛋白，印度黑墨水，分子量約200萬的藍色葡聚糖-2000等)通過實際測量求出；Vi可由g·WR求得(g為干凝膠重，單位為克；WR為凝膠的“吸水量〞，以毫升/克表示)。因此，對一層析柱凝膠床來說，只要通過實驗得知某一物質的洗脫體積就可算出它的Kd值。以上關系可用圖1表示。ⅢⅢ加樣并開始洗脫加樣并開始洗脫VeⅡViV0VeⅡViV0VeⅢ=V0+ViVeⅢ=V0+Vi圖1凝膠層析柱洗脫的三局部示意圖Vo表示外體積；Vi內體積；VeII、VeIII分別代表組分II和III的洗脫體積。Kd可以有以下幾種情況：1、當Kd=0時，那么Ve=Vo。即對于根本不能進入凝膠內部的大分子物質(全排阻)，洗脫體積等于空隙體積〔圖1組分Ⅰ〕。2、當Kd=1時，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全滲入凝膠內部時，洗脫體積應為空隙體積與內體積之和〔圖1組分Ⅲ〕?？梢钥闯觯瑢δ骋荒z介質，兩種全排出的分子即Kd都等于零，雖然分子大小有差異，但不能有別離效果。同樣兩種分子如都能進入內部空隙，即Kd都等于1，它們即使分子大小有不同，也沒有別離效果。因此不同型號的凝膠介質，有它一定的使用范圍。3、當0<Kd<1時，Ve=Vo+KdVi。表示內體積只有一局部可被組分利用，擴散滲入，Vo即在Vo與Vo+Vi之間變化〔圖1組分Ⅱ〕。4、有時Kd>1時，表示凝膠對組分有吸附作用，此時Ve>Vo+Vi。例如一些芳香化合物的洗脫體積遠超出理論計算的最大值，這些化合物的Kd>1。在實際工作中，對小分子物質也得不到Kd=1的數(shù)值，特別是交聯(lián)度大的凝膠差異更大，這是由于一局部水相與凝膠結合較牢固，成為凝膠本身的一局部，因而不起作用，小分子不能擴散人內所致。此時Vi不能由g·WR計算，為此也常有直接用小分子物質D2O，NaCl等通過凝膠柱而由實驗計算出Vi值的。另一個解決的方法是不使用Vi與Kd．而用Kav(有效分配系數(shù))代替Kd，其定義如下：Kd=〔Ve-Vo〕/ViVt-Vo代替Vi，那么：Kav=〔Ve-Vo〕/〔Vt-Vo〕即Ve＝Vo+Kav(Vt-Vo)這在實際上將原來以水作為固定相(Vi)改為水與凝膠顆粒Vt-Vo作為固定相．而洗脫劑(Ve-Vo)作為流動相。Kav與Kd對交聯(lián)度小的凝膠差異較小，而對交聯(lián)度大的凝膠差異大。Ve與相對分子質量的關系：對同一類型的化臺物，洗脫特性與組分的相對分子質量有關，流過凝膠柱時，按從大小順序流出，分子量大的走在前面。Ve與分子量的關系可用下式表示：Ve=K1-K2logMK1與K2為常數(shù)．M為相對分子質量。凝膠層析技術操作方便，設備簡單，重復性好，而且條件溫和，一般不引起生物活性物質的變化，目前已得到相當廣泛的應用，例如可用于脫鹽，濃縮高分子物質的溶液，生化物質的別離提純，去除熱原物質以及用于測定高分子物質的分子量。二、試劑和器材【試劑】1、標準蛋白質：藍色葡聚糖-2000〔200KD〕，牛血清血蛋白〔67KD〕，胃蛋白酶〔36KD〕，CytC(13.7KD)等，均為分析純。2、洗脫液：0.2mol/LTris-HCl-KCl，pH7.5取0.5MKCl20ml，0.2MTris25ml，0.1MHCl40.3ml，再加H2O定容至100ml3、SephadexG-75〔或G-100〕?！酒鞑摹繉游鲋褐?*40cm；核酸蛋白檢測儀〔或紫外分光光度計〕；局部收集器刻度試管。三、操作步驟〔一〕凝膠柱的準備1、凝膠的選擇和處理[1]凝膠的選擇：凝膠的型號很多，型號不同，篩分范圍不同。市售的Sephadex的別離范圍，常用高聚糖或球蛋白測定。SephadexG型一般適用于別離蛋白質，假設用于別離核酸，那么限于其空間結構和所帶基團的影響，選用高于他們分子量范圍的型號，或那么選用適當型號的生物膠和Sephadex1。在去除蛋白質溶液中的鹽類時，可選用凝膠SephadexG-25。當溶液通過G-25柱時，蛋白質被排阻在凝膠外面先流出來，而鹽類那么擴散到凝膠網孔里后流出來，這樣就使蛋白質得到純化。一般來說，在規(guī)定的篩分范圍內，混合物之間分子量差異越大，別離效果越好。[2]凝膠的處理：葡聚糖凝膠是以干粉保存的，因此使用前必須將干凝膠浸泡于將要用作洗脫劑的相同溶液中，充分溶脹后才能使用。根據層析柱的體積和所選用的凝膠，膨脹后的床體積，計算所需凝膠于粉的重量，將稱好的干粉傾入過量的洗脫液中，一般多為蒸餾水、鹽溶液或緩沖液，放置于室溫，使之充分吸水溶脹。注意不要劇烈攪拌，以防顆粒破碎。浸泡時間根據凝膠交聯(lián)度不同而異，為了縮短溶脹時間，可在100℃恒溫水浴箱中加熱溶脹，這樣可大大縮短溶脹時間至幾小時，而且還可殺死細菌和霉菌，排除凝膠內部包藏著的氣泡。但是，必須防止置于酸或堿溶液中加熱。凝膠顆粒最好大小比擬均勻，這樣流速穩(wěn)定，結果較好。如果顆粒大小不勻，可以在浸泡時用傾瀉法將不易沉下的較細的顆粒傾去。裝柱前最好將溶脹好的凝膠置真空枯燥器中抽真空，以除盡凝膠中的空氣。2、凝膠柱的制備[1]柱的選擇：層析柱是所有層析方法的主要組成局部。因此，對層析柱〔包括體積和長度等〕選擇的合理與否，將直接影響別離效果。當用同樣直徑的層析柱別離兩種以上的物質時，長層析柱比短的分辨率高；當用同樣長度的層析柱別離兩種以上的物質時，層析柱直徑大的比小的分辨率高；當用同樣體積的層析柱別離兩種以上物質時，仍時層析柱長的比短的分辨率高。一般理想的層析柱之直徑和長度之比是1：25～100。層析柱最好有架套，這樣溫度可以控制，得到的結果可以重復。[2]裝柱：層析柱必須粗細均勻，柱管大小可根據實際需要選擇。一般柱直徑〔半徑〕為1cm，如果樣品樣比擬多，最好用直徑2-3cm柱。但假設直徑太小時會發(fā)生“壁管效應〞，即在柱管中心局部組分移動較慢，而在管壁周圍移動較快，因而影響別離效果。一般說來，柱越長，別離效果愈好，但柱過長，實驗時間長，而且樣品稀釋度大，易擴散，別離效果反而不好。一般來說，用于脫鹽時，柱高50cm比擬適宜；在進行分級別離時，100cm高就已足夠。裝柱方法與一般柱層析法相似，柱管可用一般柱層析管，柱的下端縮口，底部目前常用多孔的聚乙烯片做底板。底下用棉花或玻璃纖維填棄。如用燒結玻璃砂板做底，盡管用細孔的〔3號〕，粗孔的那么要在其上鋪一層濾紙或尼龍濾布。先加適量溶劑到柱內，排走其中的空氣，然后把預先用溶劑浸泡好的凝膠攪勻，隨即將此懸浮液連續(xù)傾入柱內，待其自然沉降至柱高的1/4～1/3時，翻開柱下端出口，讓溶劑慢慢流入，使柱上端懸浮液面緩慢下降至需要的高度。要注意顆粒間沒有夾雜氣泡，最好不用分次填裝法或稀的凝膠懸浮液裝柱。凝膠沉集后，將溶劑放出，再通過2-3倍柱床體積的溶劑使柱床穩(wěn)定，然后在凝膠外表上放一片濾紙或尼龍濾布，以防在加樣時凝膠被沖起來。[3]凝膠柱的鑒定：紅色葡聚糖或細胞色素C等配成2毫克/毫升的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下降。如果凝膠是均勻的，沒有“紋路〞、裂縫或氣泡，才可以使用，否那么就必須重新裝柱。要注意在任何時候不要使液面低于凝膠外表，否那么水分揮發(fā)，凝膠變干，別離效果變壞，并有可能混有氣泡，影響液體在柱內的流動。3、加樣加樣量與測定方法和層析柱大小有關。測定樣品含量的方法靈敏或床柱體積小時，加樣量可少。否那么反之。例如，一般測定蛋白質的含量多用紫外分光光度法。當采用280nm觀察消光讀數(shù)時，加樣量需5mg左右〔柱體積2*60cm〕；當采用220nm觀察消光讀數(shù)時，加樣量只需要1.2mg左右。加樣量掌握得當，可提高別離效果。一般來說，加樣量越少，或加樣體積越小〔樣品濃度高〕，分辨率越高。但用于樣品的制備和脫鹽時，加樣量應在不影響分辨率的前提下增大。此外，樣品的粘度也影響層析的分辨率，樣品的粘度大比小分辨率低。因此，一般使用的樣品粘度應小于2，或者與洗脫液的粘度相當為宜。加樣的方法與一般柱層析法相同，將柱中多余的液體放出后，將樣品溶液小心加到凝膠柱上，翻開管夾，使樣品溶液流入柱內。然后參加溶劑或鹽溶液洗脫。4、洗脫所有洗脫液均以能溶解洗脫物質和不使其變性或失活為原那么。洗脫用的液體應與浸泡膨脹凝膠所用的液體相同，否那么由于更換溶劑，凝膠體積發(fā)生變化而影響別離效果。洗脫所用的液體有水〔多用于別離不帶電荷的中性物質〕及電解質溶液〔用于別離帶電基團的樣品〕，如酸、堿、鹽的溶液及緩沖液等。對于吸附較強的組分，也有使用水與有機溶劑的混合液，中水-甲醇，水-乙醇，水-丙酮等，如以此作為洗脫劑，可以減低吸附，將組分洗下。洗脫時的流速要嚴格控制。否那么收集的每一局部洗脫體積就不會恒定，理想的分配系數(shù)就難以測出?？刂屏魉俚淖詈醚b置是恒流泵，它不僅可以使流速恒定，而且還可以使其在較大范圍內選擇。假設無此裝置，可用控制操作壓的方法進行。事實上，大多數(shù)實驗室是采用后一種方法進行控制流速的。流速在洗脫液加在柱上的壓力〔因液面差造成〕有關。凝膠層析與一般離子交換樹脂不同，加壓超過一個極限值，不僅不能增加速度，反而使流速急劇下降。流速對交聯(lián)度不同的凝膠是不同的。對交聯(lián)度大的凝膠〔G-10至G-50型〕，流速與柱的壓力差成正比，與柱長成反比，與柱的直徑無關。對交聯(lián)度小的凝膠〔G-75至G-200型〕，流速與柱的直徑有關，并在一定的適宜操作壓差下有最大的流速。流速亦受顆粒大小影響，顆粒大時流速較大，但流速大時洗脫峰形狀較寬，顆粒小時流速較慢，別離情況較好。在操作時應根據實際需要，在不影響別離效果的情況下，盡可能使流速不致太慢，以免時間過長。5、柱的重新填裝由于在洗脫過程中，所有組分一般可全部自柱上洗下，所以裝好一次柱管之后，可以反復使用，無須特殊的“再生〞處理。但由于在使用過程中，顆粒可能漸漸沉積壓緊，因此在使用一段時間后，流速可能漸漸減低，使一次分析時間拖長很久，這時需要將凝膠倒出，重新填裝，或者用反沖方法，使凝膠松動沖起，再行降沉。有時流速改變是由于柱頂上有灰塵集聚，那么需將外表層除去。由于葡萄糖凝膠為糖類化合物，并且一定要在液相中操作，所以有必要注意防止發(fā)霉與生長細菌。一般可用0.02%的疊氮鈉〔NaN3〕溶液，它極易溶于水，不與蛋白質和糖反響，也不改變他們的層析效果。也可用0.002%的洗必泰〔hibitane〕溶液。在弱酸性溶液中可用0.05%〔0.01-0.02%〕三氯丁醇溶液，但它在強堿性溶液或加熱到60度以上時就要分解。在弱堿性溶液中也有用0.01%乙醇溶液防腐消毒。一般不用氯仿、丁醇、甲苯等為防腐劑，因為它們能引起凝膠顆粒的收縮，同時還能進入層析儀器的塑料部件，使塑料變軟，造成不良后果。6、凝膠的保存方法：凝膠用完后可用以下方法保存：(1)、膨脹狀態(tài)：即在水相中保存，可參加上述防腐劑，或加熱滅菌后于低溫保存?！?〕、半收縮狀態(tài)：用完后用水洗凈，然后再用60-70%乙醇洗，那么凝膠體積縮小，于低溫保存?！?〕、枯燥狀態(tài)：用水洗凈后，參加含乙醇的水洗，并逐漸加大含醇量，最后用95%乙醇洗，那么凝膠水收縮，再用乙醚洗去乙醇，抽慮至干，于60-80度枯燥后保存。這三種方法中，以枯燥狀態(tài)保存為最好?！捕秤闷咸烟悄z層分析法測定蛋白質的分子量：凝膠層析的操作方法如上所述。測定蛋白質的分子量根據需要可選用SephadexG-75,G-100或G-150型凝膠凝膠顆粒一般在40-120微米，柱管選用直徑，高90-100cm。1、標準曲線的制定：層析柱用1X40cm，凝膠用SephadexG-75〔或G-100〕。[1]蛋白質標準樣品混合液：分別稱取4mg藍色葡萄糖-2000〔分子量200，000〕、牛血清蛋白〔分子量67，000〕，胃蛋白酶〔分子量36，000〕，Cytc〔分子量：13，700〕共同溶于2mlPH7.50.025mol/LTris-HCl緩沖液中。[2]上柱和脫洗：將標準樣品混合液上柱，然后用PH7.50.025mol/LTris-HCl溶液洗脫。用局部收集器收集，3ml/管，紫外檢測儀280nm處檢測。或收集后用紫外分光光度計于280nm處測定每管的A值，以管號(或洗脫體積)為橫坐標，A值為縱坐標繪出洗脫曲線。根據洗脫峰位置量出每種蛋白質的洗脫體積〔Ve〕。然后以蛋白質分子量的對數(shù)〔1gM〕為橫坐標，Ve為縱坐標，作出標準曲線。2、未知數(shù)品分子量的測定：完全按照標準曲線的條件操作，根據紫外檢測的洗脫峰位置，測出洗脫體積。〔三〕實驗結果與分析1、洗脫曲線的繪制以管號(或洗脫體積)為橫坐標，A值為縱坐標繪出洗脫曲線如圖2圖2凝膠層析柱洗脫示意圖2、洗脫體積表根據洗脫峰位置可以得出四種蛋白質的洗脫體積〔Ve〕，藍色葡聚糖-2000=6*3ml=18ml；牛血清白蛋白Ve=7*3ml=21ml；胃蛋白酶Ve=8*3ml=24ml；CytcVe=12*3ml=36ml。其結果如下表1。表1四種蛋白質的相對分子質量與洗脫體積藍色葡聚糖-2000牛血清蛋白胃蛋白酶Cytc洗脫體積Ve〔ml〕18212436相對分子質量200，00067,00036,00013,700相對分子質量對數(shù)5.34.84.64.13、選擇曲線繪制以表1中蛋白質分子量的對數(shù)(lgM)為橫坐標，Ve為縱坐標，得出選擇曲線如圖3。圖3選擇曲線4、結果分析凝膠層析柱洗脫示意圖有較為明顯的四個峰值，即在第6管，第10管，第14管，第21管，分別對應的OD值為0.195、0.140、0.119、0.300，再結合標曲，可以看出本實驗大體上別離了4種蛋白，沒有到達基線別離的效果。就其原因可能是加樣時間間隔不夠，洗脫速度稍快或者裝柱不夠均勻造成的拖尾現(xiàn)象。從標曲制作結果來看R2=0.8916<0.99，說明該標曲線性不佳，也間接顯示出本次凝膠層析別離效果不佳。凝膠層析是生化實驗中常用的實驗，關鍵影響因素有：膠的選擇和制備，即要求根據不同的別離目標選擇不同的適宜的別離膠和洗脫液，制備過程中一定要保證膠的充分溶解吸漲。攪拌時動作要柔和，以免弄破凝膠顆粒和產生氣泡。在裝柱時保證柱子的均勻和防止氣泡的產生。在層析過程中，保證一定的流速和電壓，使洗脫盡力充分。5、原始數(shù)據記錄表，如表2.表2原始數(shù)據記錄表編號A280加樣順序10.012藍色葡聚糖-2000〔200KD〕20.00530.00640.003牛血清白蛋白〔67KD〕50.01260.19570.130胃蛋白酶(36KD)80.02490.085100.140CytC(13.7KD)110.067120.024130.094140.119150.049160.027170.034180.016190.061200.235210.300220.202230.114240.070250.050270.010280.002實驗二小麥種子儲藏蛋白——HMW-GS的別離一、目的利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠〔SDS〕研究小麥種子儲藏蛋白〔高分子量麥谷蛋白亞基HMW-GS〕組成結果。此外，SDS也是測定蛋白質亞基分子質量的常用方法，通過本實驗，掌握SDS的根本原理、技術和應用。二、實驗原理用十二烷基硫酸鈉〔SDS〕和復原劑〔巰基乙醇或二硫蘇糖醇〕熱處理蛋白質樣品，蛋白質分子中的二硫鍵被復原，解離的亞基與SDS發(fā)生定量結合后使得蛋白質亞基帶上大量的負電荷，從而掩蓋了蛋白質各種亞基間原有的電荷差異。亞基的構像均呈長橢圓棒狀，各種蛋白質亞基-SDS復合物表現(xiàn)出相等的電荷密度，在電場中的遷移速度僅與亞基分子質量有關。因此，SDS可以用來別離蛋白質亞基并測定其蛋白質亞基的分子質量。三、實驗器材和試劑1、儀器：電泳儀、垂直板電泳槽、臺式高速離心機、加樣槍，燒杯50ml2個、移液管2、試劑和材料：(1)70%乙醇。(2)50%正丙醇〔含2%β-巰基乙醇〕250ml：正丙醇125ml，β-巰基乙醇5ml，加水至250ml。(3)樣品提取緩沖液〔母液〕：4克SDS，11.5mlH2O，20ml甘油，25mlPH6.8、0.5molTris-Hcl，25mg溴酚藍。(4)樣品提取液：27.2ml母液+4.8mlβ-巰基乙醇+64mlH2O。或母液：水：β-巰基乙醇=1：1：0.02。(5)30%丙烯酰胺+甲叉雙丙烯酰胺：丙烯酰胺〔Acr〕150g，甲叉雙丙烯酰胺〔Bis〕4g定容至500ml。(6)別離膠緩沖液〔Tris-Hcl〕PH8.8：18.17gTris，用Hcl調PH至8.8定容至1000ml。(7)濃縮膠緩沖液〔Tris-Hcl〕PH6.8：15.1gTris用Hcl調PH至6.8g定容至250ml。(8)10%SDS〔W/V〕(9)10%〔W/V〕過硫酸胺。(10)TEMED〔四甲基乙二胺〕，4℃棕色瓶儲藏。(11)電極緩沖液〔10X〕500ml：72g甘氨酸，15.15Tris，5gSDS。(12)染色液：45%甲醇+45%水+10%冰醋酸+0.02%考馬斯亮藍R250(13)漂洗劑：10%甲醇+80%水+10%冰醋酸。四、實驗步驟1、樣品的提取(1)取一粒種子研磨粉碎成粉狀，參加70%乙醇1000ml，10分鐘后，12000轉離心8分鐘，倒掉乙醇并晾干。(2)加50%正丙醇〔含2%β-巰基乙醇〕250ml混勻后，50℃水浴1.5小時，中途需要振蕩，然后放入12000轉離心8分鐘。(3)取上清液加3倍體積丙酮置于-20℃冰箱2小時。(4)12000轉離心8分鐘，倒掉丙酮晾干，加樣品提取液250ul，待溶解完全后，在沸水浴煮沸3分鐘即可，再在12000離心3分鐘。上清液用于點樣。2、SDS—PAGE分析(1)組裝電泳槽：見電泳槽使用說明書。(2)凝膠的制備：取兩只干凈燒杯〔50ml〕標號，按下表試劑配方進行配膠。在配膠前先用別離膠的十分之一封底，保證不能漏膠。然后再在電泳槽中先置別離膠，待別離膠聚合后，倒掉乙醇溶液，再灌濃縮膠，灌好濃縮膠后迅速插入樣品梳靜置聚合。別離膠用量15ml，濃縮膠用量5ml。表1凝膠的制備試劑配方聚丙烯酰胺凝膠組成別離膠〔10%〕濃縮膠〔3%〕30%丙烯酰胺〔Acr〕+甲叉雙丙烯酰胺〔Bis〕ml2.50.62別離膠緩沖液PH8.8Tris-Hcl〔含SDSTEMED〕ml0.2-濃縮膠緩沖液PH6.8Tris-Hcl〔含SDSTEMED〕ml-13H2Oml2.95310%Ap過硫酸胺ul10075(3)加樣及電泳待凝膠聚合完全后，拔掉電泳梳子。然后將電泳槽注滿電極緩沖液。取適量10和15ml上清液加樣，在標準泳道點上高分子量標準蛋白質溶液。上槽接負極，下槽接正極，恒流20mA電泳，待溴酚藍走出別離膠后30分鐘停止電泳〔約2小時〕，取出玻璃板,剝膠染色。(4)染色剝下的膠用蒸餾水洗滌后參加染色液，蓋上蓋子，放入微波爐低溫染色3分鐘，每隔一分鐘取出振蕩，取出。(5)脫色將染色液倒回瓶內，參加漂洗液至背景無色，照相保存。3、結果處理量出染料和條帶的遷移距離，按下式計算相對遷移率MRMR=樣品遷移距離/染料遷移距離五、結果與分析結果如圖1圖1SDS條帶圖條帶不是很清晰，可能是在制備凝膠時出現(xiàn)誤差。出現(xiàn)兩邊翹起中間凹下條帶。其原因是由于凝膠的中間局部凝固不均勻所致，這種現(xiàn)象多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。條帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，其原因主要是樣品融解效果不佳或別離膠濃度過大引起的。四個樣品中有三個條帶的位置根本一致，說明四個樣品中至少含有三種以上的相同蛋白亞基。根據不同條帶顏色的深淺可以看出不同種類的蛋白亞基的含量是有差異的。又由不同相對分子量的蛋白亞基的遷移速度不同，可看出各蛋白亞基間的相對分子質量存在較大差異。實驗三豬血中超氧化物歧化酶〔SOD〕的別離純化及活力測定、同工酶電泳1概述SOD(SuperoxideOrgoteinDismutase)，別名肝蛋白、奧谷蛋白，是一種含有金屬元素的活性蛋白酶，是中國衛(wèi)生部批準的具有藥物功能的物質之一，法定編號為，CAS號：[905489]1。1938年Marn等人首次從牛紅血球中別離到SOD，1969年McCord等重新發(fā)現(xiàn)這種蛋白，并且發(fā)現(xiàn)其生物活性，弄清了它催化過氧陰離子發(fā)生歧化反響的性質，正式將其命名為SOD，到目前為止，人們對SOD的研究己有七十多年的歷史。SOD具有特殊的生理活性，在生物體內的水平上下是表觀衰老與死亡的直接指標?，F(xiàn)已證實，由氧自由基引發(fā)的疾病多達60多種。SOD可對抗和阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞，復原因自由基造成的細胞傷害。由于現(xiàn)代生活壓力，環(huán)境污染，各種輻射和超量運動都會造成氧自由基大量形成，故生物抗氧化機制中SOD的地位越來越重要。SOD廣泛存在于動物、植物和微生物中，是一種能專一地去除超氧離子自由基(O2-)的金屬酶。它具有抗衰老，抗輻射，抗炎和抗癌等作用，在醫(yī)藥、化裝品、食品工業(yè)等方面具有了廣闊的應用前景。1.1分類SOD以多個常見形式存在，以銅、鋅、錳、鐵、鎳作為輔因子，按其所含金屬輔基不同可分為三種：①含銅〔Cu〕鋅〔Zn〕金屬輔基〔Cu/Zn-SOD〕：是最為常見的一種酶，綠色，主要存在于機體細胞漿中。Cu/Zn-SOD是一個二聚體，分子量為32500，兩個亞基主要通過疏水和靜電相互作用結合在一起，銅和鋅那么與活性位點上的組氨酸側鏈形成配位鍵；②含錳〔Mn〕金屬輔基〔Mn-SOD〕：紫色，存在于真核細胞的線粒體和原核細胞內。錳離子與三個組氨酸的側鏈、一個天冬氨酸的側鏈和一個水分子或羥基〔取決于錳的氧化態(tài)〕配位結合；③含鐵〔Fe〕金屬輔基〔Fe-SOD〕：黃褐色，存在于原核細胞中。在自然界中，Cu/Zn-SOD幾乎存在于所有真核細胞中，而一些細菌只含F(xiàn)e-SOD或Mn-SOD，還有一些那么兩種都含有，Mn-SOD和Fe-SOD的活性位點具有同樣類型的氨基酸與金屬離子配位。在人體中〔哺乳動物和大多數(shù)脊索動物相似〕，SOD也含有三類：SOD1定位于細胞質中；SOD2位于線粒體；SOD3那么位于細胞外。SOD1為二聚體，而其他兩類那么為四聚體。SOD1和SOD3的活性位點含有銅和鋅，而SOD2那么含有錳。它們的基因分別定位于21號、6號和4號染色體〔〕。1.2作用原理有害物質的超氧陰離子在SOD的作用下和氫離子反響，生成另一種物質—過氧化氫，過氧化氫又在過氧化氫酶的作用下和氫離子反響，最終生成了一種對人體無害的物質—水。在超氧化物歧化酶〔SOD〕、過氧化氫酶〔CAT〕、過氧化物酶〔POD〕三種酶的協(xié)同作用下，O2-最終轉化為水，使機體得到保護。1.3功能機體的衰老與體內氧自由基的產生與積累密切相關，SOD可去除人體內過多的有害的氧自由基，從而保護組織和器官免受傷害，具有重要作用。例如SOD最直接的功能是抗衰老和抗氧化；以此為根底，SOD可以有效預防慢性病和老年性白內障，降低輻射病風險及輻射防護、抗疲勞、防止二次傷害；SOD還能有效降低血脂、膽固醇、血壓，可預防動脈粥樣硬化，抑制心腦血管疾??；臨床上還使用SOD治療紅斑狼瘡自身免疫性疾病和初期肺氣腫；目前，SOD最主要的用途是用于化解女性氧化危機，主要是用于美膚產品，現(xiàn)在已有多種產品進入市場，并具有很好的效果。2研究現(xiàn)狀近年來，國內外的專家學者主要研究了SOD與植物抗逆性的關系。研究說明，在逆境條件下，植物的抗性與植物體內能否維持較高的SOD活性水平有關。環(huán)境脅迫能誘導植物SOD基因的表達。當前，不同類型的SOD基因已被轉化到多種植物中，有實驗結果說明，SOD在轉基因植物中的過量表達可以不同程度地提高植物對環(huán)境脅迫的抵抗能力。因此，可利用基因工程方法來獲得抗逆植株。2023年，張飛等人報道了黃芪多糖對早期斷奶仔豬血清中SOD，MDA及NO的影響；高福元等人報道了冬季低溫對4種彩葉植物SOD,POD活性影響的研究；周科等人報道了2,2′,4,4′-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)污染沉積物對銅銹環(huán)棱螺肝胰臟的SOD、CAT和EROD活性的影響；2023年，劉等人報道了艾灸預處理后，GSH-Px、SOD和MDA活性對大鼠胃黏膜應激性潰瘍的影響；劉紅旭等人研究了參元丹后處理對心肌缺血/再灌注大鼠血清MDA,SOD水平的影響；2023年，薛錚等人研究了鹽酸氨基葡萄糖對膝骨關節(jié)炎患者關節(jié)液中SOD和MDA水平的影響；梁迪思等人報道了北蟲草不同部位超氧化物歧化酶(SOD)酶活力的比擬；2023年，Haberle等人報道了SOD的構效關系及影響細胞的氧化復原為根底的信號轉導途徑；Paital等人研究了抑制劑，鹽度和季節(jié)對泥蟹的超氧化物歧化酶表達調節(jié)同工酶的影響。3SOD測定方法SOD的催化底物是O2-·，一般多以一定時間內產物生成量或底物的消耗量作為酶活性單位。由于O2-·自身很不穩(wěn)定，且不易制備，測定SOD的方法除少數(shù)采用直接法外，一般多為間接法。3.1直接法原理是根據O2-·或產生O2-·的物質本身的性質測定O2-·的歧化量，從而確定SOD的活性。經典的直接法包括：脈沖輻射分解法、電子順磁共振波法〔EPR〕、核磁共振法。由于所需的儀器設備價格昂貴，一般較少應用。3.2一般化學法這些方法的共同特點是要有一個O2-·的產生體系和一個被O2-·復原或氧化的可檢測體系。在SOD存在下，一局部O2-·被SOD歧化，因而O2-·復原或氧化檢測體系的反響受到抑制。根據反響受抑制程度，測定SOD的活性。一般化學法有鄰苯三酚自氧化法、細胞色素C復原法、羥胺法、黃嘌呤氧化酶-NBT法、腎上腺素法、沒食子酸法、6-羥多巴胺法、亞硝酸鹽形成法和堿性二甲亞砜法。鄰苯三酚自氧化法(改進Marklund法)原理是基于經典的分光光度法，在堿性條件下，鄰苯三酚自氧化成紅桔酚，用紫外-可見光譜跟蹤波長為325nm、420nm或650nm，同時產生O2-·，SOD催化O2-·發(fā)生歧化反響從而抑制鄰苯三酚的自氧化，樣品對鄰苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映樣品中的SOD含量。本法具有特異性強，所需樣本量少〔僅50μl〕，操作快速簡單，重復性好，靈敏度高，試劑簡單等優(yōu)點。細胞色素C復原法〔McCord法〕原理是黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系中產生的O2-·使一定量的氧化型細胞色素C復原為復原型細胞色素C，后者在550nm有最大光吸收。在SOD存在時，由于一局部O2-·被SOD催化而歧化，O2-·復原細胞色素C的反響速度那么相應減少，即其反響受到抑制。將抑制反響的百分數(shù)與SOD濃度作圖可得到抑制曲線，由此計算樣品中SOD活性。本法是間接法中的經典方法，但本法靈敏度較低。黃嘌呤氧化酶-細胞色素C法原理是在有氧的條件下，黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤發(fā)生氧化反響生成尿酸，與此同時產生O2-·，O2-·氧化型細胞色素C復原為復原型細胞色素C，后者在550nm處有最大吸收。存在SOD時，O2-·被催化而歧化,細胞色素C復原反響速率那么降低。根據細胞色素C在參加SOD前后被O2-·復原的速率變化測定SOD活性?；瘜W發(fā)光法原理是黃嘌呤氧化酶在有氧條件下，催化底物黃嘌呤或次黃嘌呤發(fā)生氧化反響生成尿酸，同時產生O2-·。后者可與化學發(fā)光劑魯米諾反響，使其產生激發(fā)。SOD能去除O2-·從而抑制魯米諾的化學發(fā)光。本法可應用于SOD的微量測定，不僅靈敏度高，簡便易行，而且特異性與準確性至少與細胞色素C復原法類似。免疫學方法上述方法測定的是SOD活性，免疫學方法那么可測定樣品中SOD的質量，因此特異性較好，是較理想的測定SOD方法，免疫法有放射免疫法、化學發(fā)光免疫分析法、ELISA法等。但其缺陷是只能測定抗體相應的抗原，對于檢測不同種類的SOD，那么須制備相應的特異性抗體，手續(xù)繁瑣。電泳法電泳染色定位法原理是根據光化學法與NBT復原法。電泳那么采取垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳。既可采用SOD活性正染色〔呈現(xiàn)棕色區(qū)帶〕也可采取SOD活性負染色〔呈現(xiàn)無色透明區(qū)帶〕。根據凝膠上電泳別離的SOD區(qū)帶的著色深淺與面積大小，對樣品進行半定量分析，也可制作校正曲線計算樣品中的SOD含量。染色定位法常用于鑒定SOD，很少為了定量，主要原因是它不及化學法簡便，但鑒定SOD卻較化學法為優(yōu)。用電泳法可鑒定SOD是否摻有雜質蛋白，有無同工酶，且可半定量地確定SOD的活性大小。羥胺發(fā)色法原理是鄰苯三酚自氧化產生的O2-·與羥胺反響生成亞硝酸鹽，在酸性條件下，亞硝酸鹽與氨基苯磺酸和N-甲萘基二氨基乙烯反響生成紅色化合物，而SOD抑制此反響，根據抑制率上下計算活性。此外，SOD活性的測定方法還有氮藍四唑(NBT)改進法、極譜氧電極法、堿性二甲基亞砜法、堿性連二亞硫酸鈉法等。4蛋白質測定蛋白質的測定方法有很多種，主要有以下幾種。4.1凱氏定氮法原理凱氏定氮法測定蛋白質分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定4個過程。其原理是樣品中含氮有機化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化，含氮有機物分解產生氨，氨又與硫酸作用,變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨,氨用過量的硼酸溶液吸收，再用鹽酸標準溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質含量。特點凱氏定氮法是目前分析有機化合物含氮量常用的方法，是測定試樣中總有機氮最準確和最簡單的方法之一，被國際國內作為法定的標準檢驗方法。凱氏定氮法樣品的最正確消化條件為硫酸銅2.50g,硫酸鉀0.10g,濃硫酸4.00mL；硫酸銅的用量為影響消化時間的主要因素，硫酸鉀和濃硫酸用量為第二和第三主要因素；用此最正確條件做實驗，消化時間僅為12min；與其他硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸用量方法比照，該法所需消化時間最短,試劑用量減少，可降低實驗本錢，也降低了對環(huán)境的污染。凱氏定氮法適用范圍廣泛，測定結果準確,重現(xiàn)性好，但操作復雜費時，試劑消耗量大。假設采用模塊式消化爐代替?zhèn)鹘y(tǒng)的消化裝置，可同時測定幾份樣品，節(jié)省時間，提高了工作效率，適用于批量蛋白質的測定,具有準確、快速、簡便、低耗、穩(wěn)定的優(yōu)點。4.2雙縮脲法(Biuret)原理雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個分子脲經180℃左右加熱,放出1個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反響。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能夠以1個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反響。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關,故可用來測定蛋白質含量。特點雙縮脲法中樣品的取用量對測定結果的準確性有顯著影響，采用0.5g樣品，40mL雙縮脲試劑的比例具有較高的檢測精度。雙縮脲法對不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，不受溫度的影響?？煽焖贉y定蛋白質含量，試劑單一，方法簡便，但靈敏度差，測定范圍為1～20mg蛋白質。適用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質測定，常用于谷物蛋白質含量測定。4.3紫外吸收法原理蛋白質分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的性質，吸收峰在280nm處，吸光度(即光密度值)與蛋白質含量成正比。此外,蛋白質溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系，可以進行蛋白質含量的測定。特點最常用的紫外吸收法是280nm的光吸收法，含有核酸的蛋白質溶液使用280和260nm的吸收差法較好。蛋白質的稀溶液采用215與225nm的吸收差法。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定，測定后仍能回收使用。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質濃度的變化，而不需知道其絕對值。缺點是測定蛋白質含量的準確度較差，干擾物質較多，在用標準曲線法測定蛋白質含量時，對那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質有一定的誤差，故該法適于用測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。假設樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質，會出現(xiàn)較大的干擾。核酸在紫外區(qū)也有強吸收，但通過校正可以消除。但是因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經過校正，測定的結果還是存在一定的誤差。此外，進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質吸收頂峰常因pH的改變而有變化,因此要注意溶液的pH值，測定樣品時的pH要與測定標準曲線的pH相一致。4.4考馬斯亮藍G-250法本實驗樣品中蛋白質含量用考馬斯亮藍G-250法測定?？捡R斯亮藍G-250〔CoomassicbrilliantblueG-250〕在游離狀態(tài)下呈紅色，與蛋白質結合后呈現(xiàn)藍色。在一定范圍內，溶液在595nm波長下的光密度與蛋白質含量成正比，可用比色法測定，測定范圍在1～1000μg。原理Bradford法是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的?？捡R斯亮藍是一種有機染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中與蛋白質的堿性氨基酸〔特別是精氨酸〕和芳香族氨基酸殘基結合后變?yōu)樗{色，其最大吸收波長從465nm變?yōu)?95nm，蛋白質在1～1000μg范圍內，蛋白質－色素結合物在595nm波長下的吸光度與蛋白質含量成正比，故可用于蛋白質的定量測定特點考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合反響十分迅速而穩(wěn)定，2min左右即到達平衡，其結合物室溫下1h內保持穩(wěn)定，且在5～20min之間，顏色的穩(wěn)定性最好。該法方法簡便，易于操作，所用試劑較少，顯色劑易于配制。干擾物質少,如糖、緩沖液、復原劑和絡合劑等均不影響顯色。此法的缺點是由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用γ-球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。該方法適用于要求靈敏度高、快速定量測定微量蛋白質的測定。根據國際兩學委員會規(guī)定，酶的比活性用每mg蛋白質具有的酶活性單位(u/mg.pr)來表示。因此，測定樣品的比活性必需測定〔1〕每ml樣品中的蛋白質mg數(shù)(mg/ml)；(2)每m1樣品中的酶活性單位數(shù)(u/ml)。酶的純度越高酶的比活性也就越高。本實驗采用鄰苯三酚自氧化法測定，酶活性單位定義為：規(guī)定條件下，每毫升反響液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50％的酶量定義為一個酶活性單位(U)。樣品中蛋白質含量用考馬斯亮藍G-250法測定?？捡R斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈棕紅色，與蛋白質結合呈現(xiàn)藍色。在一定范圍內，溶液在595nm波長下的吸光值與蛋白質含量成正比．可用比色法測定蛋白質含量，測定范圍1-1000ug。5實驗試劑與器材5.1試劑(1)SOD的提取：ACD抗凝劑、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿(2)SOD活力測定：50mol/LpH8.3磷酸緩沖液、10mol/LEDTA鈉鹽溶液、3mol/L鄰苯三酚溶液(3)考馬斯亮藍G-250法測蛋白質：考馬斯亮藍G-250試劑、標準蛋白質溶液5.2器材分光光度計；分析天平；具塞試管；刻度吸管；離心機；燒杯微量進樣器。6操作步驟6.1SOD的提取(1)取新鮮豬血20mI[預先按0.15：1(v/v)的比例參加ACD抗凝劑]6000r/m，10min，去上層血漿，取下層紅血球稠液，并且量其體積，然后參加2倍體積的0.9%NaCl溶液清洗，6000r/m，10min，棄上層清液，再入2倍體積的0.9%NaCl溶液重復清洗一次，6000r/m，10min，得洗凈的紅血球濃稠液。(2)向洗凈的紅血球中參加等體積的蒸餾水，劇烈攪拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中緩慢參加預冷的0.25倍體積的95%乙醇溶液和0.15倍體積的氯仿，再繼續(xù)攪拌15min，6000r/m，10min，去變性蛋白沉淀物，得上層液，留樣2ml。然后將清液在65-70℃恒溫水浴中進行熱處理，15min后取出迅速冷卻至室溫，6000r/m，5min除沉淀，得淺黃色粗酶液，留樣2ml。(3)向粗酶液中參加等體積的丙酮溶液，冰箱中靜置過夜，6000r/m，10min棄上清液，得沉淀。將沉淀物用等體積預冷的丙酮溶液洗二次，離心收集沉淀，自然枯燥即得淡藍綠色成品。按1mg/ml溶于蒸餾水，備用。6.2SOD活力測定6.2.1鄰苯三酚自氧化率的測定取4.5ml50mmol/LPH8.3的磷酸緩沖液，4.2ml蒸餾水和1ml10mol/LEDTA-Na2溶液，混勻后在25℃水浴保溫20min，取出后立即參加25℃預熱過的鄰苯三酚溶液0.3ml，迅速搖勻．倒人光徑1cm的比色杯內，用10mol/LHCI作空白，325nm波長下每隔30s測光吸收值一次，整個操作在4min內完成，計算出每分鐘A325的增值，此即為鄰苯三酚氧化率。要求自氧化速率控制在0.070/min左右。6.2.2酶活力測定操作與(1)根本一致，參加鄰苯三酚前，先參加一定體積的SOD樣液，蒸餾水那么減少相應的體積，同理測其光吸收值，計算加酶后鄰苯三酚自氧化率。6.2.3酶活性單位的計算根據酶活性單位的定義，按以下公式計算酶活性：單位活性〔U/ml〕=A其中，A0：為鄰苯三酚自氧化率；Am：加酶后鄰苯三酚自氧化率；總活性〔U〕=單位活性×酶原液總體積6.2.4蛋白質合量測定(考馬斯亮藍G-250法)(a)標準曲線的制作：取6支具塞試管，編號，按下表參加試劑。試劑管號123456蛋白質標溶液(ml)00.20.40.60.81.0蒸餾水(ml)1.00.80.60.40.20考馬斯亮藍G-250(ml)555555蛋白質含量(ug)020406080100蓋上塞子，搖勻。注意各管振蕩程度盡量一致。在595nm波長下比色測光吸收值，比色應在1h內完成。以牛血清白蛋白含量(ug)為橫坐標，光吸收值為縱坐標繪出標準曲線。(b)樣品中蛋白含量的測定將待測的SOD溶解并稀釋到一定濃度，取1支試管，準確參加0.1ml樣品提取液，加0.9m1蒸餾水和5m1考馬斯亮藍G-250試劑，其余操作與標準曲線制作相同。(c)蛋白質含量計算根據所測樣品提取液的光吸收值，在標準曲線上查得相應的蛋白質含量,計算其濃度?！瞕〕結果處理利用考馬斯亮藍G-250法測定每毫升酶原液蛋白質毫克數(shù)樣品SOD比活力(u/mg)＝單位體積活力(u/ml)位蛋白質濃度（將測得的數(shù)據或計算結果填入下表。提純步驟酶液總體積ml蛋白質mg/ml酶活性(U/ml)總活性(U)比活性U/mg回收率(%)純化倍數(shù)除血蛋白上清熱變性后上清丙酮沉淀后的7實驗結果與分析7.1SOD活力測定將含有SOD的樣1、樣2及樣3參加鄰苯三酚自氧化過程的反響液中，記錄加樣體積及每30s觀察的吸光度值，與鄰苯三酚自氧化率測定過程吸光度值同記錄如表1：表1鄰苯三酚自氧化率吸光度值計時吸光度值A325鄰苯三酚自氧化加SOD后的鄰苯三酚自氧化樣1a樣2b00:00:300.0270.0240.02200:01:000.0610.0450.03300:01:300.0960.0560.04300:02:000.1290.0680.05400:02:300.1630.0790.06500:03:000.1930.0900.0