異體樹突狀細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療微小殘留白血病的臨床研究

異體樹突狀細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療微小殘留白血病的臨床研究

近年來，細(xì)胞免疫治療已成為癌癥治療的熱點(diǎn)。由細(xì)胞因子（cytokineinducedcik）引起的損傷細(xì)胞具有高效抗血小板聚集細(xì)胞的作用，用于急性采血和淋巴瘤的治療。樹突狀細(xì)胞(dendriticcell,DC)作為一種高效抗原提呈細(xì)胞,與CIK細(xì)胞聯(lián)用可誘導(dǎo)CIK細(xì)胞特異性應(yīng)答、提高CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng),較單純CIK細(xì)胞更為完善?，F(xiàn)今急性白血病的緩解率已達(dá)50%~90%,但多數(shù)患者(除陽性急性髓系白血病)最終因?yàn)槲⑿埩舭籽?minimalresidualleukemia,MRL)的存在而復(fù)發(fā)甚至死亡,因此清除MRL是治愈白血病的關(guān)鍵。此前,本課題組采用自身DC聯(lián)合CIK(DC-CIK)細(xì)胞和中藥治療白血病取得較好療效,但自身DC-CIK細(xì)胞治療受患者身體狀況、免疫機(jī)能等因素影響,其推廣應(yīng)用受到限制。本研究觀察異體DC-CIK聯(lián)合化療治療形態(tài)學(xué)完全緩解期(completeremission,CR)但未達(dá)到分子學(xué)完全緩解(molecularCR,CRm)或MRL陽性的白血病患者的臨床效果及其治療安全性。1材料和方法1.1病例選擇及化療方案選取48例2009年1月至2011年6月石家莊平安醫(yī)院收治的白血病患者(本組病例不含PML/RARα陽性急性髓系白血病),按照WHO急性白血病診斷分型標(biāo)準(zhǔn)均診斷為CR期,但均未達(dá)CRm,或四色流式細(xì)胞微小殘留白血病免疫表型組合(four-colorcombinationflowcytometricimmunophenotypeofminimalresidualleukemia,CFIM)陽性。按照患者意愿入選聯(lián)合組24例,采用DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合鞏固化療;選擇24例同期化療患者作為對照的化療組,僅采用鞏固化療。兩組患者在性別、年齡、緩解期、病種分布、相關(guān)基因表達(dá)等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。健康半嵌合供體是經(jīng)相關(guān)病毒學(xué)檢查和健康體檢合格的患者的父母或子女。兩組患者和供者均簽署知情同意書,研究程序和治療方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)。1.2cik細(xì)胞的增殖培養(yǎng)選擇健康半嵌合供者進(jìn)行有核細(xì)胞分離,采集前用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)進(jìn)行體外動(dòng)員,當(dāng)外周血細(xì)胞密度達(dá)(3~5)×1010個(gè)/L時(shí)用血細(xì)胞分離機(jī)按Auto-PBSC程序行血細(xì)胞分離,并用淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)分離出單個(gè)核細(xì)胞,AIM-V無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為(4~6)×106個(gè)/ml,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。此時(shí)培養(yǎng)基中出現(xiàn)非貼壁細(xì)胞和貼壁細(xì)胞。收集非貼壁細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為(1~2)×106個(gè)/ml,加入1000U/ml的IFN-γ懸浮培養(yǎng)24h,加入1μg/ml的CD3單克隆抗體和1000U/ml的IL-2,每隔3d換液1次,同時(shí)補(bǔ)充IL-2和CD3單克隆抗體,調(diào)整細(xì)胞密度為(1~2)×106個(gè)/ml進(jìn)行增殖培養(yǎng),收獲CIK細(xì)胞。收集AIM-V無血清培養(yǎng)基中的貼壁細(xì)胞,在AIM-V培養(yǎng)液中加入1000U/ml的GM-CSF和1000U/ml的IL-4,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3d換液1次并補(bǔ)充細(xì)胞因子,第6天加入上述細(xì)胞因子的同時(shí)還加入IL-1β、TNF-α、PGE-2等細(xì)胞因子誘導(dǎo)DC成熟,培養(yǎng)7~8d后收獲DC。計(jì)數(shù)收獲的DC和CIK細(xì)胞,將其按1∶3的比例混合,共培養(yǎng)6d,獲得DC-CIK細(xì)胞。1.3cik細(xì)胞免疫表型檢測在DC培養(yǎng)的第8天用流式細(xì)胞儀行DC免疫表型(CD86+、CD11+)分析;在CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第8、14天分別取少量細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞儀做CIK細(xì)胞免疫表型(CD3+、CD4+、CD8+、CD56+)分析。DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng)物共培養(yǎng)6d后再次檢測以上表型。采用熒光標(biāo)記的單抗進(jìn)行染色,用COULTEREPICSXL型四色流式細(xì)胞儀檢測,用CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。1.4細(xì)胞表型檢測DC-CIK細(xì)胞混合液進(jìn)行乙肝、丙肝、梅毒、HIV病毒檢測均呈陰性,同時(shí)微生物、霉菌培養(yǎng)也均陰性;錐蟲藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性達(dá)到90%,淋巴細(xì)胞比例≥70%;有核細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)1.0×107~2.0×108個(gè)/ml;檢測細(xì)胞表型CD86+、CD11+、CD3+、CD4+、CD8+、CD56+表達(dá)30%~50%時(shí),準(zhǔn)備輸注。輸注前地塞米松5mg靜脈注射以防止過敏,生理鹽水250ml輸注時(shí)前后沖液路。當(dāng)天輸注4~6h后再靜脈輸入生理鹽水100ml+IL-2(2.0×105U),次日起輸入生理鹽水100ml+IL-2(2.0×105U),1次/d,共4d。每15d輸注1次,輸注4~6次后判斷療效。1.5阿糖胞苷、ma、ea、米托、阿糖胞苷、ma、ma、ma、ea、ma、ma、ea、h參照2009年急性髓系白血病治療的專家共識,采用TA(吡柔比星、阿糖胞苷)、HA(高三尖杉酯堿、阿糖胞苷)、MA(米托蒽醌、阿糖胞苷)、EA(依托泊甙、阿糖胞苷)、IDAD(中劑量阿糖胞苷、柔紅霉素)交替化療,每1~3個(gè)月用1次(療程5~7d)。兩組病例化療方案、療程間歇期相同。1.6cbf/mih11每次骨髓檢查時(shí)檢測白血病特異基因或相關(guān)基因,包括AML1/ETO,CBFβ/MYH11,BCR/ABL、WT1、IgH基因重排和TCRδ基因重排。連續(xù)2次陰性則每3~6個(gè)月再檢測1次,持續(xù)陰性1年以上則每6~12個(gè)月檢測1次,再檢測2次。1.7cfim、cfim的比較根據(jù)患者初發(fā)病時(shí)的白血病細(xì)胞免疫表型確定其CFIM。每次骨髓檢查時(shí)檢查CFIM,連續(xù)2次陰性后每3~6個(gè)月再檢測1次,持續(xù)陰性1年以上則每6~12個(gè)月檢測1次,再檢測2次。1.8流式細(xì)胞培養(yǎng)檢測t淋巴結(jié)亞組治療前后用流式細(xì)胞儀檢測所有48例的CD4+、CD8+T細(xì)胞比例,比較治療前后的變化。1.9dc-cik輸注前后檢查指標(biāo)(1)DC-CIK輸注次數(shù)和輸注量;(2)疾病狀態(tài);(3)每次DC-CIK輸注前后檢查患者肝腎功能、心電圖、尿液常規(guī)、大便常規(guī)。在輸注DC-CIK過程中及輸注后每天觀察出現(xiàn)的不良反應(yīng),觀察項(xiàng)目及分級參照世界衛(wèi)生組織規(guī)定的急性及亞急性毒性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。1.10研究對象的一般情況療效評價(jià)參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中急性白血病療效標(biāo)準(zhǔn)和國際工作組關(guān)于急性髓系白血病治療試驗(yàn)的診斷、療效標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)化、治療結(jié)局和報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)的修訂建議。本研究臨床隨訪至2012年6月,觀察并統(tǒng)計(jì)研究對象的CR、CCR、PR、NR和復(fù)發(fā)情況;同時(shí)對患者進(jìn)行分子血液學(xué)指標(biāo)檢測,以判斷患者的MRL的清除程度:(1)CRm:治療前表達(dá)白血病特異基因或相關(guān)基因,治療后轉(zhuǎn)為陰性。本研究規(guī)定檢測基因低于1000個(gè)拷貝為該基因陰性。(2)CFIM轉(zhuǎn)陰:本研究參照文獻(xiàn)的規(guī)定,CFIM檢測MRL細(xì)胞數(shù)<0.01%為陰性。(3)MRL清除:本研究規(guī)定,連續(xù)2次白血病特異基因或相關(guān)基因陰性,或連續(xù)2次CFIM陰性,判定為MRL清除。1.11ccr生存期計(jì)算采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)數(shù)資料以百分率表示,采用χ2檢驗(yàn);計(jì)量數(shù)據(jù)以表示,采用t檢驗(yàn);CCR生存期采用Kaplan-Meier法計(jì)算。以P<0.05或P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1cik細(xì)胞生長和免疫的變化DC細(xì)胞培養(yǎng)體系中,剛分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞呈球形,表面光滑,培養(yǎng)2~3h后,可見部分貼壁細(xì)胞,呈圓形,均勻散在分布;誘導(dǎo)培養(yǎng)3~4d后,為均勻散在分布的聚集體,胞體稍增大,形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞表面開始出現(xiàn)細(xì)小的樹突狀偽足;培養(yǎng)6~7d后,胞體變得更大,表面出現(xiàn)大量毛刺狀突起,具有典型樹突狀的細(xì)胞約占50%~60%,部分細(xì)胞呈半貼壁懸浮狀態(tài)。DC細(xì)胞免疫表型檢測結(jié)果顯示,CD86+細(xì)胞占(53.4±8.3)%,CD11+細(xì)胞占(50.3±9.8)%。CIK細(xì)胞培養(yǎng)體系中,非貼壁細(xì)胞在前3d內(nèi)成團(tuán)簇樣生長,細(xì)胞團(tuán)逐漸增多、增大、懸浮,細(xì)胞形態(tài)呈圓形、規(guī)則、透亮,在7~12d的增殖速度最快。非貼壁細(xì)胞初始數(shù)量平均為(1.7±0.3)×106個(gè),第7天細(xì)胞總數(shù)約為(4.9±0.8)×107個(gè),平均增長了30倍;第14天CIK細(xì)胞總數(shù)達(dá)(3.6±0.7)×109個(gè)。CIK細(xì)胞免疫表型檢測結(jié)果:CD3+CD4+細(xì)胞占(25.3±7.2)%,CD3+CD8+細(xì)胞占(65.6±10.1)%,CD3+CD56+細(xì)胞占(30.1±5.4)%。2.2納入和排除治療的治療情況聯(lián)合組24例共接受114次DC-CIK細(xì)胞治療,其中15例接受4次治療,9例接受6次治療。每次輸注的DC-CIK細(xì)胞總數(shù)為1×109~26.5×109個(gè)細(xì)胞,平均輸注量為(8.1±4.3)×109個(gè)/次。2.3u3000b細(xì)胞急性紅細(xì)胞白酒達(dá)cr聯(lián)合組有11例達(dá)CRm,其中1例輸注1次DC-CIK細(xì)胞后白血病相關(guān)基因陰轉(zhuǎn),3例3次后陰轉(zhuǎn),4例4次后陰轉(zhuǎn),2例5次后陰轉(zhuǎn),1例6次后陰轉(zhuǎn),CRm率為45.7%。達(dá)CRm所需時(shí)間為15~60d,平均為(40.7±12.2)d。11例白血病相關(guān)基因轉(zhuǎn)陰患者包括4例AML1/ETO、3例CBF/MYH11、1例WT1、3例IgH基因重排B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(曾間斷化療4年IgH基因重排仍為陽性)?；熃M白血病相關(guān)基因陰轉(zhuǎn)2例,CRm率為8.3%,其中1例AML1/ETO基因,1例IgH基因重排;達(dá)CRm所需時(shí)間分別為6個(gè)月和11個(gè)月。兩組CRm率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.55,P<0.01)。采用DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合化療達(dá)CRm的典型病例:一例BCFβ/MYH11基因陽性急性髓細(xì)胞性白血病患者,男性,24歲,化療取得緩解后只鞏固1個(gè)療程,即用DC-CIK治療,DC-CIK細(xì)胞輸注3次后BCFβ/MYH11陰轉(zhuǎn),至今保持陰性達(dá)48個(gè)月。另一例緩解后鞏固治療的B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病患者,堅(jiān)持間斷化療4年,IgH基因持續(xù)陽性,停用化療,采用DC-CIK細(xì)胞治療3次后IgH基因陰轉(zhuǎn),保持陰性至今達(dá)42個(gè)月。可見DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合化療,對促進(jìn)白血病相關(guān)基因陰轉(zhuǎn),取得CRm有確切的效療。2.4cfim陰轉(zhuǎn)和各基因型分布聯(lián)合組CFIM轉(zhuǎn)為陰性水平者16例,CFIM轉(zhuǎn)陰率66.7%。CFIM轉(zhuǎn)陰者包括4例AML1/ETO陽性急性髓性白血病、3例BCFβ/MYH11基因陽性急性髓系白血病、1例WT1基因陽性AML-2、3例IgH基因重排B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病、3例AML-M2、1例AML-M4和1例AML-M5患者。CFIM陰轉(zhuǎn)的中位時(shí)間為60d,均為DC-CIK細(xì)胞輸注3次以上者?；熃MCFIM轉(zhuǎn)為陰性者6例,CFIM陰轉(zhuǎn)率25.0%,其中1例AML1/ETO基因、1例IgH基因重排、3例AML-M2、1例AML-M4患者。聯(lián)合組CFIM陰轉(zhuǎn)率較化療組顯著提高(χ2=8.39,P<0.01)。2.5化療組和對照組的ml陰性比較聯(lián)合組16例達(dá)MRL陰性,清除率66.7%;化療組6例達(dá)MRL陰性,清除率25.0%。兩組MRL清除率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.39,P<0.01)。2.6cd4+t/cd8+t細(xì)胞比值的變化聯(lián)合組患者治療后外周血中CD4+T細(xì)胞比例、CD8+T細(xì)胞比例無顯著的變化(P>0.05),但CD4+T/CD8+T細(xì)胞比值顯著上升[(1.3±0.4)vs(0.8±0.4),P<0.05];而化療組治療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群比例無明顯變化(P>0.05)(表2)。2.7化療組與cr、3年以上ccr比較隨訪至2012年6月,中位隨訪時(shí)間為32個(gè)月(12~38個(gè)月)。聯(lián)合組24例中19例保持CR達(dá)3年以上,3年以上CCR達(dá)79.2%;僅5例在3年內(nèi)復(fù)發(fā)?；熃M24例中11例CR達(dá)3年以上,3年以上CCR達(dá)45.8%;13例在3年內(nèi)復(fù)發(fā)。聯(lián)合組患者3年以上CCR率較化療組顯著提高(χ2=5.69,P<0.05)。2.8地塞米松緩沖劑DC-CIK細(xì)胞輸注后,6例患者出現(xiàn)發(fā)熱,體溫37.5~40.2℃,多發(fā)生于細(xì)胞輸注后0.5~2h,持續(xù)1~3h消退,伴有全身乏力、肌肉酸痛,用地塞米松能很快緩解。未見外周血紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板的明顯降低,無肝功、腎功、心肌酶、血糖及電解質(zhì)的異常變化。隨訪至2012年6月,未見患者的心、肝、腎等重要器官功能損害,未見感染性疾病、第二腫瘤等發(fā)生。3異體dc-cik細(xì)胞聯(lián)合化療的安全性分析目前,化療可使多數(shù)急性白血病獲得CR,CR后除M3型及兒童標(biāo)準(zhǔn)危險(xiǎn)組B細(xì)胞ALL外,其他患者的長期CCR率<50%,多數(shù)<30%,其原因多為MRL得不到清除而復(fù)發(fā),因此急性白血病CR后MRL的清除仍是治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)?；煂RL作用有限,采用細(xì)胞免疫治療清除MRL是目前的研究熱點(diǎn)。體外研究發(fā)現(xiàn),健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)DC和CIK細(xì)胞,由于DC能夠增加CIK細(xì)胞的增殖能力和抗白血病活性,將DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)所獲得的DC-CIK細(xì)胞有顯著的抗白血病作用,對耐藥白血病細(xì)胞和白血病干細(xì)胞也有殺傷作用。DC-CIK細(xì)胞抗白血病機(jī)制主要有:(1)CIK細(xì)胞對白血病細(xì)胞的直接殺傷,在體內(nèi)受某些淋巴因子作用后,CIK細(xì)胞大量釋放具有細(xì)胞毒性的胞質(zhì)顆粒到胞外,這些顆粒直接破壞腫瘤細(xì)胞;(2)進(jìn)入體內(nèi)的DC-CIK細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子,如干擾素-γ、TNF-α和IL-2等,不僅對白血病細(xì)胞有直接抑制作用,而且還可通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)間接殺傷白血病細(xì)胞;(3)CIK細(xì)胞由于有抗凋亡基因表達(dá),因此在體內(nèi)能抵抗FasL陽性白血病細(xì)胞對CIK細(xì)胞的反作用,故CIK細(xì)胞能對白血病細(xì)胞持久地發(fā)揮作用。鄧琦等采用自身DC皮下注射聯(lián)合CIK靜脈輸注治療34例緩解后急性白血病,所有患者治療結(jié)束后均處于血液學(xué)和遺傳學(xué)緩解狀態(tài),T細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子水平和微小殘留病灶檢測取得滿意結(jié)果,治療期間8例出現(xiàn)一過性低熱反應(yīng),無其他不良反應(yīng)。周東風(fēng)等回顧性總結(jié)了47例兒童急性白血病患者緩解后采用自身骨髓培養(yǎng)的DC-CIK細(xì)胞靜脈回輸治療,結(jié)果顯示,CCR率達(dá)93.62%,治療前MRL陽性的9例患兒8例治療后轉(zhuǎn)陰,治療中少數(shù)患者僅見發(fā)熱、皮疹輕微不良反應(yīng),隨訪5~72個(gè)月未見心、肝、腎等重要器官功能損害,未見感染性疾病、第二腫瘤等的發(fā)生。白血病復(fù)發(fā)的