7第六章-轉(zhuǎn)基因與作物育種匯總

1轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種2作物轉(zhuǎn)基因育種就是依據(jù)育種目標(biāo)，從供體生物中分別目的基因，經(jīng)DNA重組與遺傳轉(zhuǎn)化或直接運(yùn)載進(jìn)入受體作物，經(jīng)過篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的遺傳工程體，并經(jīng)過田間試驗(yàn)與大田選擇育成轉(zhuǎn)基因新品種或種質(zhì)資源。轉(zhuǎn)基因作物〔GMC，geneticallymodifiedcrops〕什么是轉(zhuǎn)基因育種?3與常規(guī)育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因育種在技術(shù)上較為簡(jiǎn)單，要求也很高，但是具有常規(guī)育種所不具備的優(yōu)勢(shì)：1.拓寬可利用的基因資源；2.培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗優(yōu)良品種供給了嶄新的育種途徑；3.可以對(duì)植物的目標(biāo)性狀進(jìn)展定向變異和定向選擇；4.可以大大提高選擇效率，加快育種進(jìn)程。此外，還可將植物作為生物反響器生產(chǎn)藥物等生物制品。4TraditionalcrossbreedingRecombinantDNAtechniques5

一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進(jìn)呈現(xiàn)狀第一節(jié)作物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)自從1983年第一株轉(zhuǎn)基因煙草獲得以來，至今已有120種植物轉(zhuǎn)基因獲得成功。1996年全球大面積種植，并不斷擴(kuò)大。國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用效勞局〔ISAAA〕統(tǒng)計(jì)結(jié)果6世界銀行下屬機(jī)構(gòu)猜測(cè)，世界范圍內(nèi)轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)的交易額：2023年到達(dá)60億美元；2023年到達(dá)200億美元，1500萬農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物種植國(guó)家先后有30多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)了3000多例田間試驗(yàn)，涉及的植物種類有40多種；2023年有13個(gè)國(guó)家種植商品化轉(zhuǎn)基因植物；2023年有17個(gè)國(guó)家種植商品化轉(zhuǎn)基因植物?！?023年〕美國(guó)〔59%〕，阿根廷〔20%〕，加拿大〔6%〕中國(guó)〔5%〕，歐洲很少2023年3月英國(guó)批準(zhǔn)大面積種植轉(zhuǎn)基因，但要求特別嚴(yán)格。2023年德國(guó)通過法案，嚴(yán)格限制〔包括試驗(yàn)室爭(zhēng)論〕。7美國(guó)：3900萬公頃加拿大：350萬公頃阿根廷：1350萬公頃中國(guó)：210萬公頃8轉(zhuǎn)基因作物種類主要為大豆、玉米、棉花和油菜等，以轉(zhuǎn)基因大豆面積最大。

目標(biāo)性狀抗除草劑：2023年使用抗除草劑大豆、玉米和棉花占轉(zhuǎn)基因作物74%?？瓜x和抗病毒?。?023年，Bt玉米、Bt棉花占19%。耐除草劑+抗蟲性雙價(jià)的轉(zhuǎn)基因棉花和玉米占7%。9美國(guó)三大轉(zhuǎn)基因作物歷年種植面積10Firstbiotechplantproduct–Flav’rSav’rtomato11我國(guó)轉(zhuǎn)基因作物爭(zhēng)論與利用概況

我國(guó)是世界上第一個(gè)商品化種植轉(zhuǎn)基因作物的國(guó)家。自行培育的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因煙草的抗病蟲性到達(dá)60％，產(chǎn)量比比照增加15％，產(chǎn)值增加20％，1992年每畝增收200元，圓滿的是由于市場(chǎng)的緣由現(xiàn)已不推廣。到1999年我國(guó)已批準(zhǔn)中試的轉(zhuǎn)基因作物有48項(xiàng)：包括水稻、小麥、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、煙草、廣藿香等11種作物；主要目標(biāo)性狀是抗蟲、抗病、耐鹽、抗凍、耐貯存和抗年輕等。已批準(zhǔn)環(huán)境釋放的有49個(gè)品種，涉及水稻、玉米、大豆、馬鈴薯、番茄、甜椒、線辣椒、棉花、楊樹、煙草等10種作物。12經(jīng)全國(guó)基因工程安全委員會(huì)批準(zhǔn)商品化生產(chǎn)的作物已有：我國(guó)自行研制開發(fā)的抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花〔轉(zhuǎn)Bt及Bt+CpTI雙價(jià)抗蟲棉〕；2023年種植轉(zhuǎn)基因棉花370萬公頃，占棉花種植面積的50%美國(guó)Monsanto公司開發(fā)的Bt抗蟲棉；延遲成熟期的轉(zhuǎn)基因番茄；抗黃瓜花葉病毒(CMV)轉(zhuǎn)基因番茄；抗CMV轉(zhuǎn)基因甜椒；轉(zhuǎn)查爾酮合酶〔CHS〕反義RNA基因矮牽牛。13由中國(guó)農(nóng)科院生物工程中心開發(fā)的Bt棉對(duì)棉鈴蟲有顯著的抗性。與比照相比削減農(nóng)藥用量80％，并削減用工150個(gè)/hm2，以上兩者可使每公頃節(jié)省1500元，Bt轉(zhuǎn)基因棉種深受棉農(nóng)的歡送。14二、 轉(zhuǎn)基因育種的程序基因分別體外重組轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體安全性評(píng)價(jià)結(jié)合常規(guī)育種轉(zhuǎn)基因品種遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)市場(chǎng)開發(fā)載體的構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因槍轟擊篩選15(一)目的基因的獲得依據(jù)獲得基因的途徑主要可以分為兩大類：依據(jù)基因表達(dá)的產(chǎn)物—蛋白進(jìn)展基因克隆；從基因組DNA或mRNA序列克隆基因。1.依據(jù)基因表達(dá)的產(chǎn)物—蛋白進(jìn)展基因克隆主要步驟如下：利用這種方法人類首次人工合成了胰島素基因。雖然在早期承受這種方式已經(jīng)成功地克隆了很多基因。局限性：兼并密碼子效率低未知基因及產(chǎn)物分別蛋白質(zhì)明確氨基酸序列推導(dǎo)核苷酸序列人工合成162.從基因組DNA或mRNA序列克隆基因(1)同源序列法(HomologyBasedCandidateGeneMethod)依據(jù)基因家族成員所編碼的蛋白質(zhì)構(gòu)造中具有保守氨基酸序列的特點(diǎn)克隆基因家族未知成員。氨基酸序列比較設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增文庫篩選/RACE17(2)表達(dá)序列標(biāo)簽EST是指能夠特異性標(biāo)記某個(gè)基因的局部序列，通常包含了該基因足夠的構(gòu)造信息區(qū)，可以與其它基因相區(qū)分。主要是通過cDNA的途徑獲得。獲得EST的途徑:大規(guī)模cDNA文庫測(cè)序各種mRNA水平的分析手段mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄酶cDNA文庫PCR差異顯示抑制消減雜交…ESTRACE/文庫篩選dbESTGenBank18(3)依據(jù)連鎖圖譜克隆目的基因圖位克隆技術(shù)(Map-basedcloning)19MarkercM10.8aGenecbpBAC染色體步移亞克隆cDNA文庫篩選互補(bǔ)試驗(yàn)精細(xì)定位染色體步移候選基因20(4)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法轉(zhuǎn)座子是染色體上一段可復(fù)制、移動(dòng)的DNA片段。當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到某個(gè)功能基因內(nèi)部時(shí)，就會(huì)引起該基因的失活，并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型；當(dāng)轉(zhuǎn)座子再次轉(zhuǎn)座或切離這一位點(diǎn)時(shí)，失活基因的功能又可得到恢復(fù)。目前應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是Ac/Ds玉米轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。插入突變體篩選突變DNA文庫，PCR，RACE鑒定性狀遺傳分析轉(zhuǎn)座子DNA探針基因局部DNA探針篩選野生型DNA文庫，PCR，RACE完整目的基因互補(bǔ)試驗(yàn)21(5)差異顯示法在生物個(gè)體發(fā)育不同階段，或不同的組織與細(xì)胞中或不同環(huán)境下，基因表達(dá)差異。即不同基因有序的時(shí)空表達(dá)方式，叫做基因的差異表達(dá)。差異顯示PCR(differentialdisplay-PCR,DD-PCR)是指通過對(duì)來源特定組織類型的總mRNA進(jìn)展PCR擴(kuò)增、電泳，并找出待測(cè)組織和比照之間的特異擴(kuò)增條帶。葉mRNA根mRNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR隨機(jī)引物+3’

錨定poly(t)引物PCR葉根22(6)cDNA微陣列,cDNA芯片cDNA序列〔純樣〕機(jī)器點(diǎn)樣在支持物,與熒光標(biāo)記的不同mRNA樣品分別進(jìn)展雜交,通過激光共聚焦掃描分析不同cDNA序列的雜交信號(hào)強(qiáng)度,推斷該cDNA在不同mRNA樣品中的表達(dá)豐度.mRNA1mRNA223(6)電子克隆insilicocloning借助于電子計(jì)算機(jī)，利用公布的核酸序列資料，進(jìn)展序列的拼接和組裝最終獲得完整基因序列的技術(shù)，類似于cDNA文庫的篩選但更加便利和快速。24〔二〕目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建目的基因體外重組到適當(dāng)?shù)囊迅脑斓馁|(zhì)粒中包括保存用中間載體〔大腸桿菌寄主〕：pBR322、pUC、pBluescriptK、pKS,pGEM-T生殖載體〔大腸桿菌寄主〕：JM109,TOP10植物轉(zhuǎn)化載體〔農(nóng)桿菌寄主〕：pBI121,pCAM100125分別基因克隆到某中間載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒限制酶切/連接克隆到植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌基因槍轉(zhuǎn)化pKS,pBR332,pGEM-TJM109,TOP10…HindIII/EcroI…T4ligasepBI121,pCAM1001…LBA4404,EHA26農(nóng)桿菌:usedextensivelyforgeneticengineeringofplants.包含Ti質(zhì)粒

Tumorinducingplasmid(bacterialplasmid)T-DNA(Transferred-DNA),

可以轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物基因組.TumorinducedbyA.tumefaciens27TiPlasmidT-DNAregionLeftborderRightbordervirgenesori農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞后，只留在細(xì)胞間隙中。T-DNA首先在細(xì)菌中被加工、剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。auxin28Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子，其分子量為95～156×106D,約有200kb組成。依據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)?？梢员环殖伤姆N類型：章魚堿型(octopine)胭脂堿型(nopaline)農(nóng)桿堿型〔agropine〕農(nóng)桿菌素堿型〔agrocinopine〕或稱琥珀堿型(succinamopine)Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型29Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域

〔1〕T-DNA區(qū)〔transferred-DNAregions〕：農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)?！?〕Vir區(qū)〔virulenceregion〕該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一?！?〕Con區(qū)〔regionsencodingconjugations〕該區(qū)段上存在著與細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因〔tra〕，調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)?！?〕Ori區(qū)〔originofreplication〕該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。30野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙：①Ti質(zhì)粒分子量過大，一般在160～240kb，比pBR322質(zhì)粒大50倍左右；②大型的野生Ti質(zhì)粒上分布著各種限制酶的多個(gè)切點(diǎn)，不能通過體外DNA重組技術(shù)直接向野生型Ti質(zhì)粒導(dǎo)入外源基因；③T-DNA區(qū)內(nèi)含有很多編碼基因，其中Onc基因的產(chǎn)物干擾宿主植物中內(nèi)源激素的平衡，轉(zhuǎn)化細(xì)胞長(zhǎng)成腫瘤，阻礙細(xì)胞的分化和植株的再生；④Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制,即使得到重組質(zhì)粒，也只能在農(nóng)桿菌中進(jìn)展擴(kuò)增；⑤Ti質(zhì)粒上還存在一些對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。31雙元載體系統(tǒng):binaryTivectorsystem32載體構(gòu)建中常用的選擇標(biāo)記如何選擇和篩選轉(zhuǎn)化體同樣是一個(gè)重要問題?？茖W(xué)家家始終試圖把轉(zhuǎn)化體帶上一個(gè)標(biāo)記，從而便于選擇和篩選。至今己建立了很多標(biāo)記基因，并已插入各種轉(zhuǎn)化載體中，作為一種標(biāo)記基因。33必需具備以下四個(gè)條件：①編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶；②基因較小，可構(gòu)成嵌合基因；③能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達(dá)；④檢測(cè)簡(jiǎn)潔，并且能定量分析。細(xì)菌篩選標(biāo)記基因：產(chǎn)物賜予細(xì)胞產(chǎn)生一種選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)、發(fā)育與分化。而轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)該標(biāo)記產(chǎn)生抗性，不影響其生長(zhǎng)等，從而將轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇出來，例如，Cat〔氯霉抗性基因〕。植物篩選標(biāo)記基因：強(qiáng)調(diào)給轉(zhuǎn)化細(xì)胞帶上一種標(biāo)記，起報(bào)告和識(shí)別作用，故稱報(bào)告基因。34報(bào)告基因:

Gus基因〔β-葡糖苷酸酶基因〕在植物細(xì)胞中所產(chǎn)生的葡糖苷酸酶在檢測(cè)上具有以下特點(diǎn)：①在肯定條件下與X-G1ucuionicacid〔5-bromo-4-chioro-3-indoyl-β-D-glucuronicacid〕底物發(fā)生作用，產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，既可以用分光光度計(jì)法測(cè)定，又可以直接觀看到植物組織中形成的藍(lán)色斑點(diǎn)。②當(dāng)參加4-甲基傘形酮基和葡萄糖苷酸時(shí)生成4-甲基傘形酮，發(fā)熒光〔λ=465nm〕。因而可以用熒光光譜法測(cè)定。由于熒光強(qiáng)度高，本底低，故熒光檢測(cè)極為靈敏。③檢測(cè)簡(jiǎn)潔、快速并能定量，只需少量植物組織抽提液即可在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定完畢。④價(jià)格廉價(jià)。3536GFP〔綠色熒光蛋白基因〕;

LUC(螢火蟲熒光素酶基因);報(bào)告基因:37啟動(dòng)子的選擇35S,cauliflowermosaicvirus35Spromoter

CaMV35Sisastrongpromoterthatisactiveinessentiallyalldicotplanttissues.

38(三〕受體材料的選擇

受體是指用于承受外源DNA的轉(zhuǎn)化材料。良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)滿足如下條件：1、高效穩(wěn)定的再生力量；2、受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性；3、外植體來源便利，如胚和其它器官等；4、對(duì)篩選劑敏感；5、轉(zhuǎn)化率高39常用的受體材料有以下幾大類型:1.愈傷組織再生系統(tǒng)外植體材料經(jīng)過脫分化培育誘導(dǎo)形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化〔帶有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染〕，分化培育獲得再生植株。優(yōu)點(diǎn)：外植體來源廣，生殖快，易承受外源基因，轉(zhuǎn)化效率高。缺點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng)402.直接分化再生系統(tǒng)外植體材料細(xì)胞不經(jīng)過脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。優(yōu)點(diǎn)：周期短、操作簡(jiǎn)潔，體細(xì)胞變異小，遺傳穩(wěn)定；缺點(diǎn)：材料局限，轉(zhuǎn)化率低。3.原生質(zhì)體再生系統(tǒng)原生質(zhì)體恢復(fù)細(xì)胞壁具有分化再生力量，是應(yīng)用最早的再生受體系統(tǒng)之一。優(yōu)點(diǎn)：高效、廣泛地?cái)z取外源DNA或遺傳物質(zhì)，獲得基因型全都的克隆細(xì)胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；缺點(diǎn)：不易制備、再生困難和變異程度高。414.胚狀體再生系統(tǒng)是指具有胚胎性質(zhì)的個(gè)體。優(yōu)點(diǎn)：個(gè)體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，承受外源基因力量強(qiáng)，嵌合體少，易于培育、再生。缺點(diǎn)：技術(shù)含量高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。5.生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)以生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞等受體細(xì)胞進(jìn)展外源基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。一是利用組織培育技術(shù)進(jìn)展小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培育、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過程進(jìn)展基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。42〔四〕轉(zhuǎn)基因方法概括起來說主要有兩類：第一類是以載體為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化，也稱為間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)法。其次類是外源目的DNA的直接轉(zhuǎn)化。431.載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)最常見的轉(zhuǎn)基因方法。將外源基因重組進(jìn)入適合的載體系統(tǒng)，通過載體將攜帶的外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，整合在核染色體組中并隨核染色體復(fù)制和表達(dá)。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?！瞭umor-inducingplasmid〕或Ri質(zhì)粒(root-indcing

plasmid)介導(dǎo)法是迄今為止植物基因工程中應(yīng)用最多、機(jī)理最清晰、最抱負(fù)的載體轉(zhuǎn)移方法。44農(nóng)桿菌共培育侵染誘導(dǎo)愈傷組織分化生芽生根葉盤轉(zhuǎn)化法(1)葉盤法雙子葉植物較為常用、簡(jiǎn)潔有效的方法。45(2)真空滲入法將適宜轉(zhuǎn)化的強(qiáng)健植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌滲入培育基的容器中，經(jīng)真空處理，造傷，使農(nóng)桿菌通過傷口感染植株，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。簡(jiǎn)便、快速、牢靠，不需要組織培育。(3)愈傷組織共培育(4)原生質(zhì)體共培育462.外源基因直接導(dǎo)入法〔1〕化學(xué)刺激法細(xì)胞融合劑：聚乙二醇〔PEG〕、聚乙烯醇〔PVC〕47(2)基因槍轟擊法〔微彈轟擊技術(shù)micro-projectilebombardment)將外源DNA包裹在微小的鎢粉或金粉顆粒的外表，借助高壓動(dòng)力射入受體細(xì)胞或組織，最終整合到植物基因組并得以表達(dá)。步驟簡(jiǎn)潔易行：適合于大多數(shù)細(xì)胞或組織，抑制了受體材料的限制，不必制備原生質(zhì)體，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，已經(jīng)成為植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化最有效方法之一。到目前為止，利用基因槍法已經(jīng)在煙草、豆類和多數(shù)禾本科農(nóng)作物、果樹花卉和林木等植物上獲得轉(zhuǎn)基因植株。單子葉植物481.Pericarpsholudbepulledbackandtheimmatureembryos(0.5-1.0mm)areremoved.2.TheimmatureembryosareplacedonacallusinductionmediumhighosmoticmediapreparecallifortransfomationTransformationisperformedbygenegunmethod4950(4)微注射法細(xì)胞操作：利用瓊脂糖包埋、聚賴氨酸粘連和微吸管吸附等方式將受體細(xì)胞〔原生質(zhì)體或生殖細(xì)胞〕固定，然后將供體DNA或RNA直接注射進(jìn)入受體細(xì)胞。子房注射法或花粉管通道法：具有較大子房或胚囊的植株可在田間進(jìn)展活體操作。操作簡(jiǎn)便、本錢低。51〔五〕轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定1.轉(zhuǎn)化體的篩選外源目的基因轉(zhuǎn)化頻率低目的基因已被整合到核基因組并表達(dá)轉(zhuǎn)化細(xì)胞更少使用特異性選擇標(biāo)記基因〔selectablemarkergenes〕進(jìn)展標(biāo)記，有效地選擇出真正轉(zhuǎn)化細(xì)胞。常用選擇標(biāo)記基因：抗生素抗性基因除草劑抗性基因?qū)⑦x擇標(biāo)記基因與適當(dāng)啟動(dòng)子構(gòu)成嵌合基因，克隆到質(zhì)粒載體上，與目的基因同時(shí)進(jìn)展轉(zhuǎn)化。標(biāo)記基因在受體細(xì)胞表達(dá)，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有反抗相應(yīng)抗生素或除草劑的力量而存活下來。非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則被抑制、殺死。522.轉(zhuǎn)化體的鑒定通過篩選得到的再生植株初步證明標(biāo)記基因整合進(jìn)入受體細(xì)胞。至于目的基因是否整合到受體核基因組、是否表達(dá)，還必需對(duì)抗性植株進(jìn)一步檢測(cè)。DNA水平的鑒定檢測(cè)內(nèi)容：是否整合、拷貝數(shù)、整合位置。檢測(cè)方法：特異性PCR〔以外源基因兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物〕Southern雜交〔外源目的基因序列為探針〕53特異性PCR檢測(cè)外源基因整合到受體54(2)轉(zhuǎn)錄水平的鑒定常用的方法Northern雜交〔標(biāo)記的RNA為探針對(duì)總RNA雜交〕RT-PCR檢測(cè)mRNAcDNAPCR5556〔3〕翻譯水平的鑒定為檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA能否翻譯，還必需進(jìn)展翻譯或者蛋白質(zhì)水平檢測(cè)。主要方法：Western雜交免疫檢測(cè)57〔六〕轉(zhuǎn)化體的安全性評(píng)價(jià)和育種利用依據(jù)有關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的治理規(guī)定、在可掌握的條件下進(jìn)展安全性評(píng)價(jià)和大田育種利用爭(zhēng)論。通過轉(zhuǎn)基因方法往往難以直接獲得抱負(fù)的品種〔系〕緣由：外源基因失活、純合致死、花粉致死、其它性狀變化等。因此獲得轉(zhuǎn)化體后，應(yīng)結(jié)合雜交、回交、自交等常規(guī)轉(zhuǎn)育手段，最終選育綜合性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因品種。58其次節(jié)轉(zhuǎn)基因作物的遺傳特點(diǎn)少數(shù)外源基因整合到植株能穩(wěn)定遺傳，正常表達(dá)，符合孟德爾遺傳。大多失活或表現(xiàn)簡(jiǎn)單的遺傳方式。緣由：外源基因受宿主基因組排斥而發(fā)生片段喪失、重排；多拷貝；整合隨機(jī)性；一、整合機(jī)制1、同源重組2、位點(diǎn)特異性重組3、轉(zhuǎn)座4、特別重組59二、整合后外源基因表現(xiàn)不表達(dá)1、基因喪失2、基因沉默表達(dá)1、符合孟德爾遺傳2、獨(dú)立轉(zhuǎn)化體之間差異3、無規(guī)律60第三節(jié)轉(zhuǎn)基因作物品種的選育

純系育種回交育種雜交育種雜交種61第四節(jié)轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性62直至今日，轉(zhuǎn)基因作物的安全性在全球范圍內(nèi)引起了劇烈的爭(zhēng)論。反對(duì)者認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物具有極大的潛在危急，可能會(huì)對(duì)人類安康和人類生存環(huán)境造成威逼。在歐洲，轉(zhuǎn)基因作物被一些媒體稱之為“惡魔食品”〔frankensteinfood〕。Frankenstein是英國(guó)科幻小說中由一個(gè)科學(xué)家制造、最終又消滅了這個(gè)科學(xué)家的怪物。那么，人類研制與種植轉(zhuǎn)基因作物究竟是消滅自己，還是挽救自己呢？63對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的安全性爭(zhēng)論，國(guó)際上有幾個(gè)典型的大事。Pusztai大事：英國(guó)Rowett爭(zhēng)論全部位Pusztai博士，他用轉(zhuǎn)雪花蓮凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英國(guó)電視臺(tái)發(fā)表講話，聲稱大鼠食用了這種土豆后，體重和器官重量減輕，免疫系統(tǒng)受到了破壞。后果：綠色和平組織、地球之友等反生物技術(shù)組織把這種土豆說成“殺手”，并籌劃了破壞轉(zhuǎn)基因作物試驗(yàn)地等行動(dòng)，燃燒了印度的兩塊試驗(yàn)田，甚至美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校的非轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)材料也遭破壞，以致爭(zhēng)論生畢業(yè)論文都無法如期完成。英國(guó)皇家學(xué)會(huì)組織了同行評(píng)審，并于1999年５月發(fā)表評(píng)論，指出Pusztai的試驗(yàn)有六方面的錯(cuò)誤：不能確定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的化學(xué)成分有差異；對(duì)食用轉(zhuǎn)基因土豆的大鼠，未補(bǔ)充蛋白質(zhì)以防止饑餓；供試動(dòng)物數(shù)量少，飼喂幾種不同的食物，且都不是大鼠的標(biāo)準(zhǔn)食物，缺少統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；試驗(yàn)設(shè)計(jì)差；統(tǒng)計(jì)方法不當(dāng)；試驗(yàn)結(jié)果無全都性等。64斑蝶大事：1999年5月，康奈爾大學(xué)的一個(gè)爭(zhēng)論組在《Nature》雜志上發(fā)表文章，聲稱轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的花粉飄到一種名叫“馬利筋”的雜草上，用馬利筋葉片飼喂美國(guó)大斑蝶，導(dǎo)致44％的幼蟲死亡。這一試驗(yàn)結(jié)果在科學(xué)上沒有說服力：玉米的花粉特別重，集中不遠(yuǎn)，在玉米地以外５米，馬利筋葉片/CM2上只找到一個(gè)玉米花粉；2023年開頭在美國(guó)三個(gè)州和加拿大進(jìn)展的田間試驗(yàn)都證明，抗蟲玉米花粉對(duì)斑蝶并不構(gòu)成威逼，試驗(yàn)室試驗(yàn)中用１０倍于田間的花粉量來喂大斑蝶的幼蟲，也沒有覺察對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育有影響。斑蝶削減的真正緣由，一是農(nóng)藥的過度使用，二是墨西哥生態(tài)環(huán)境的破壞。65加拿大“超級(jí)雜草”大事：由于基因漂流，在加拿大油菜地里覺察了個(gè)別油菜植株可以抗一種、兩種或三種除草劑，因而有人稱此為“超級(jí)雜草”，并怪罪于轉(zhuǎn)基因。基因漂流并不是從轉(zhuǎn)基因作物開頭。假設(shè)沒有基因漂流，就不會(huì)有進(jìn)化，世界上也就不會(huì)有這么多種的植物和現(xiàn)在的作物栽培品種。舉例來說，小麥由Ａ、Ｂ、Ｄ三個(gè)基因組組成，它是由分別帶有Ａ、Ｂ、Ｄ基因組的野生種經(jīng)過基因漂流合成的。所以，以此來制止轉(zhuǎn)基因作物，也是沒有道理的。66中國(guó)Ｂt抗蟲棉破壞環(huán)境大事：2023年6月3日，南京環(huán)科所與綠色和平組織在北京召開會(huì)議，６月４日《Chinadaily》上發(fā)表了題為“GMCottonDamageEnviroment”的文章。當(dāng)天,綠色和平組織在其網(wǎng)站上登載了南京環(huán)科所、綠色和平組織參謀薛達(dá)元先生長(zhǎng)達(dá)26頁的英文報(bào)告，從而再次引發(fā)國(guó)際爭(zhēng)論，在歐、美產(chǎn)生巨大反響。６月５日德國(guó)《農(nóng)業(yè)報(bào)》發(fā)表了題為“中國(guó)爭(zhēng)論：Ｂｔ棉破壞環(huán)境巨大”。綠色和平組織的“中國(guó)工程主管”聲稱：“棉農(nóng)將面對(duì)不受掌握的超級(jí)害蟲”、“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉不但沒有解決問題，反而制造了更多的問題”、“棉農(nóng)將被迫使用更多、更毒的農(nóng)藥”。事實(shí)上，抗蟲棉在中國(guó)實(shí)踐多年，深受寬闊棉農(nóng)的歡送。中國(guó)、美國(guó)、德國(guó)、加拿大、比利時(shí)、印度等國(guó)的科學(xué)家已在網(wǎng)上紛紛發(fā)表評(píng)論，反對(duì)綠色和平組織的觀點(diǎn)。67爭(zhēng)論的實(shí)質(zhì)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因作物的安全性已經(jīng)成了國(guó)際貿(mào)易的技術(shù)壁壘。由于某些媒體的炒作，對(duì)消費(fèi)者的心理和轉(zhuǎn)基因作物的產(chǎn)業(yè)化已經(jīng)產(chǎn)生了很大的負(fù)面影響。我們的推斷？68我們所要了解的---轉(zhuǎn)基因植物的潛在風(fēng)險(xiǎn):1.轉(zhuǎn)基因植物釋放引發(fā)“超級(jí)雜草”目前轉(zhuǎn)入植物的基因以抗除草劑的為多，其次以抗蟲和抗病毒，然后是抗逆。假設(shè)這些基因漸漸在野生種群中定居后，就具有選擇優(yōu)勢(shì)的潛在可能，成犯難以掌握的“超級(jí)雜草”。692.轉(zhuǎn)基因植物中35S啟動(dòng)子的生物安全性啟動(dòng)子是基因表達(dá)所必需的，打算了外源基因表達(dá)空間、表達(dá)時(shí)間和表達(dá)強(qiáng)度等，是人們定向改造生物的重要限制因素。最常用的啟動(dòng)子是35S啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠在植物組織中高水平表達(dá)。因此已經(jīng)被引入很多轉(zhuǎn)基因植物中。潛在風(fēng)險(xiǎn)問題:35S啟動(dòng)子內(nèi)有一重組熱點(diǎn)。〔1〕假設(shè)35S啟動(dòng)子插入到隱性病毒基因組旁，可能會(huì)重新活化病毒?！?〕啟動(dòng)子插入到某一編碼毒素蛋白的基因上游，可能會(huì)增加該毒素的合成。〔3〕當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物被動(dòng)物或人類食用后，35S啟動(dòng)子可能會(huì)插入到某全都癌基因上游，活化并且導(dǎo)致癌變。703.抗生素抗性標(biāo)記基因的生物安全性抗生素抗性標(biāo)記基因是否導(dǎo)致的在環(huán)境中的傳播。目前，轉(zhuǎn)基因作物都使用細(xì)菌編碼的抗生素抗性基因作為選擇性標(biāo)記。在過去的幾年里，越來越多的報(bào)道指出:細(xì)菌可以獲得對(duì)多種抗生素的抗性。這導(dǎo)致人們開頭疑心：轉(zhuǎn)基因植物中的抗性基因是否會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)菌中。抗性標(biāo)記基因是否會(huì)通過食物在腸道中水平轉(zhuǎn)移至體內(nèi)微生物，從而影響抗生素治療的有效性?？剐詷?biāo)記基因產(chǎn)物是否使人體產(chǎn)生抗藥性〔食品安全性〕。714.轉(zhuǎn)基因食品的安全性1994年美國(guó)Caigene公司的轉(zhuǎn)基因延熟番茄經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市，成為第一例通過安全評(píng)價(jià)的轉(zhuǎn)基因植物食品。轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人類的可能危害主要有3大類：〔1〕可能含有或未知的毒素，對(duì)人體產(chǎn)生毒害作用。〔2〕可能含有或未知的過敏源，引起人體的過敏反響?！?〕食品某些養(yǎng)分成分或養(yǎng)分質(zhì)量可能產(chǎn)生變化，使人體消失某種病癥。國(guó)外對(duì)轉(zhuǎn)基因食品治理的現(xiàn)狀1.國(guó)際組織實(shí)質(zhì)等同原則表型性狀的等同成分等同2023年《卡塔赫納生物安全協(xié)定書》62個(gè)國(guó)家簽署2023年《生物安全議定書》130多個(gè)國(guó)家簽署2023年《生物技術(shù)食品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估草案》226個(gè)國(guó)家表示歡送2.美國(guó)◆1992年美國(guó)公布了轉(zhuǎn)基因作物不需由作市場(chǎng)前評(píng)價(jià)，除非它引起新的安全性問題。2023年4月，在國(guó)會(huì)科學(xué)委員會(huì)下屬的根底爭(zhēng)論委員會(huì)的調(diào)查報(bào)告中，堅(jiān)持認(rèn)為沒有科學(xué)的證據(jù)之前不能將GMF作為一個(gè)新的食品級(jí)別◆2023年1月美國(guó)政府對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米的種植公布了限令，以防止害蟲對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米中毒素形成抗藥性。美國(guó)環(huán)境愛護(hù)局限令美國(guó)大局部玉米產(chǎn)區(qū)的農(nóng)場(chǎng)主應(yīng)至少種植20％的傳統(tǒng)玉米，在同時(shí)種植玉米和棉花的地區(qū)，傳統(tǒng)玉米要到達(dá)50％◆2023年7月出臺(tái)了《轉(zhuǎn)基因食品治理草案》規(guī)定，來源于植物且被用于人類或動(dòng)物的GMF在進(jìn)入市場(chǎng)之前至少120天，生物工程制造商必需提出申請(qǐng)，并供給此類食品的相關(guān)資料，以確認(rèn)此類食品與相應(yīng)的傳統(tǒng)產(chǎn)品相比具有等同的安全性3.歐盟◆歐盟對(duì)GMF持反對(duì)態(tài)度，1998年提出轉(zhuǎn)基因技術(shù)安全性之后，其反對(duì)態(tài)度更加強(qiáng)硬。他們對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的農(nóng)作物、家畜以及再加工食品加以抵抗，尤其對(duì)美國(guó)的轉(zhuǎn)基因玉米已終止了進(jìn)口，然而對(duì)于西班牙和德國(guó)的轉(zhuǎn)基因玉米卻沒有實(shí)行措施◆歐盟的法律由兩項(xiàng)：歐盟理事會(huì)90／220令，于1990年4月公布實(shí)施，該法令中規(guī)定了轉(zhuǎn)基因生物的批準(zhǔn)程序；1997年5月《新食品法