植物組培技術(shù)存在的問題及解決方法

植物組培技術(shù)存在的問題及解決方法摘要針對(duì)當(dāng)前植物組織培養(yǎng)中存在的外植體污染、褐化和玻璃化現(xiàn)象進(jìn)行了闡述，同時(shí)對(duì)相應(yīng)的解決方法的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，并展望了植物組織培養(yǎng)的研究前景。關(guān)鍵詞植物；組織培養(yǎng)；外植體；問題；解決方法植物組織培養(yǎng)是根據(jù)植物細(xì)胞具有全能性的理論，以植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為前提的一項(xiàng)生物技術(shù)。利用植物體離體的器官，誘導(dǎo)出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。利用組培技術(shù)可以快速繁殖大量種苗，有利于品種更新，還可用于脫除病毒和無病毒種苗的繁殖[1]。1植物組織培養(yǎng)中存在的問題1.1外植體污染真菌污染和細(xì)菌污染是外植體污染的2種主要形式。其中，細(xì)菌污染是由各種細(xì)菌及內(nèi)生菌引發(fā)的，潛伏期很長(zhǎng)，有時(shí)繼代幾次后才表現(xiàn)出來。真菌污染易于發(fā)現(xiàn)，由霉菌和酵母菌引發(fā)，污染速度快，控制困難，一旦發(fā)生則損失較大[2]。污染既有可能是外植體帶入，也有可能是在培養(yǎng)過程中造成的。培養(yǎng)室滅菌不徹底，操作污染，培養(yǎng)基高壓滅菌不到位，后期培養(yǎng)過程中經(jīng)常出入等原因都有可能造成污染發(fā)生[3]。1.2外植體褐變外植體褐變是指培養(yǎng)過程中，由于外植體釋放褐色物質(zhì)導(dǎo)致培養(yǎng)基逐漸變褐，最終使外植體變成褐色而死亡。就外植體本身而言，不同的品種選擇的部位、大小、形狀、選擇的時(shí)期、預(yù)處理方式、培養(yǎng)條件（包括培養(yǎng)基的成分、狀態(tài)）、培養(yǎng)的外部環(huán)境（如光照、溫度、pH值）等都是引發(fā)褐變的原因[4]。1.3外植體玻璃化玻璃化是指培養(yǎng)過程中，組培苗的葉、嫩梢呈水漬狀（透明或半透明），芽苗矮小腫脹失綠，葉片皺縮成縱向卷伸，脆弱易碎[5]。與褐變一樣，玻璃化既有外植體本身的原因也有外部原因，是培養(yǎng)環(huán)境中一些物理、化學(xué)因素和生化因子共同作用使植物組織新陳代謝紊亂所致[6]。外植體的選擇、溫度、光照、封口的材料、培養(yǎng)基的類型等都會(huì)造成玻璃化，液體培養(yǎng)是導(dǎo)致玻璃化的主要原因[7]。2組培問題解決途徑2.1污染問題的解決（1）組培室消毒。該法常用的有紫外燈照射、空氣凈化器、甲醛熏蒸等。鄒瑜等利用蒼術(shù)、艾葉熏蒸，這種方法價(jià)格低廉，簡(jiǎn)單易行，熏蒸消毒效果好且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)[8-9]。（2）外植體消毒。袁源在青天葵組培中認(rèn)為使用5%次氯酸鈉清洗10min，可基本抑制污染，植物材料仍能正常生長(zhǎng)，升汞滅菌雖可較徹底抑制污染，但對(duì)植物傷害較大，只用于對(duì)感染的球莖滅菌[10]。（3）對(duì)于真菌污染的控制。培養(yǎng)基加入75%百菌清可濕性粉劑可以有效地控制青霉菌的污染。為了消除植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的真菌和細(xì)菌污染，而又不殺傷植物組織，采用多菌靈和青霉素混合溶液浸泡污染的組培苗莖段的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多菌靈對(duì)真菌有殺滅作用，對(duì)細(xì)菌沒有明顯作用，青霉素只對(duì)細(xì)菌有抑制作用，對(duì)污染的組培苗采用75%乙醇和0.1%HgCl2處理可徹底殺滅真菌和細(xì)菌[11]。75%代森錳鋅可濕性粉劑對(duì)枸杞組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的真菌污染具有顯著的防治效果，污染率僅僅10%，且枸杞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況良好[12]。（4）對(duì)細(xì)菌污染的控制。使用抗生素和殺菌劑（如多菌靈、甲基托布津、丙酸鈉和甲霜靈等）可有效控制細(xì)菌污染，有研究表明同時(shí)使用2種或2種以上的抗生素，效果優(yōu)于單獨(dú)使用1種抗生素，如Reed采用1215mg/L慶大霉素+1000mg/L鏈霉素效果很好。但是上述方法只是暫時(shí)的解決方案，其缺點(diǎn)是只能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)而無法將其完全殺死，且長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)組培苗產(chǎn)生不良影響。因此，還需進(jìn)一步篩選更合適的方法來消除已產(chǎn)生的污染[13]。2.2褐變問題的解決在木本植物中，單寧含量或色素含量高的植物容易發(fā)生褐變[14]。同一種植物中，幼嫩的外植體比成齡材料褐變輕[15]。褐變的發(fā)生與外植體組織中酚類化合物的數(shù)量及多酚氧化酶活性有直接關(guān)系。外植體在進(jìn)行培養(yǎng)前的處理過程中，組織中的酚類物質(zhì)部分滲入培養(yǎng)基中[16]，隨著組織的老化病變會(huì)使多酚氧化酶激活而引起褐變[17]，所以盡量選擇幼嫩的組織。外植體越小，切面與體積的比率越大，傷害及褐化程度越大[18]。冬季的芽不易生長(zhǎng)，外植體宜選用早春和秋季的材料[19]。在選擇培養(yǎng)基時(shí)，4種培養(yǎng)基的無機(jī)鹽以改良MS（大量元素減半）和1/2MS的效果最好，MS的效果較差。較低濃度的無機(jī)鹽含量有利于防止植物材料褐化[20]。另外，其pH值也與褐變程度有較大關(guān)系[17，21]。趙伶俐等認(rèn)為在蝴蝶蘭組培中培養(yǎng)基的pH值為6.5時(shí)最好[22]。在水稻細(xì)胞的培養(yǎng)基中，添加植酸（PA，有抗氧化作用）可使生色物質(zhì)的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2+結(jié)合，從而使其活力降低，可防止褐變[23]。VC為多羥基還原物質(zhì)，在酶的催化下能消耗溶解氧，使酚類物質(zhì)因缺氧而無法氧化，VC也會(huì)影響多酚氧化酶的活性，從而阻止酚類物質(zhì)氧化[24]。在培養(yǎng)基中加入活性炭500.0mg/L，有利于減輕褐變[25]。在進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，不利的環(huán)境條件都能造成細(xì)胞的程序化死亡，光照過強(qiáng)[26]或溫度過高[16，27]，會(huì)提高PPO的活性，促進(jìn)多酚類物質(zhì)的氧化，從而加速被培養(yǎng)組織的褐變。因此，初期培養(yǎng)要在黑暗或弱光下進(jìn)行[21]。2.3玻璃化問題的解決增加自然光照。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，玻璃苗放于自然光下幾天后莖、葉變紅，玻璃化逐漸消失，因自然光中的紫外線能促進(jìn)試管苗成熟，加快木質(zhì)化[28]。通過加大晝夜溫差可以降低玻璃化的程度[29]。盡可能采用大一點(diǎn)的容器培養(yǎng)，并且盡可能地減小接種密度[30]。馬濟(jì)民認(rèn)為和蒸餾水相比自來水更能克服桉樹組織培養(yǎng)過程中的玻璃化現(xiàn)象[31]。降低培養(yǎng)容器內(nèi)部環(huán)境的相對(duì)濕度[32]。有學(xué)者認(rèn)為玻璃苗是培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)氣體與外界交換不暢造成的。密閉的封瓶口材料是導(dǎo)致玻璃化的原因之一。用塑料膜和透氣性薄膜都能很好地避免玻璃苗的發(fā)生，但采用塑料瓶加上透氣膜時(shí)會(huì)更好一些[33]。Deberg的研究表明，隨瓊脂濃度的增加，KT利用率降低。同時(shí)也證明，隨BA濃度的增加，玻璃化率增加[34]。培養(yǎng)基中高的含氮量，特別是高的氨態(tài)氮，也是導(dǎo)致玻璃化的因素[7，34-35]。試驗(yàn)表明，適當(dāng)增加組培瓶封口膜的透氣性，瓊脂濃度選擇6.0g/L及碳源選擇蔗糖，均可以有效地防止草莓玻璃化苗的發(fā)生[32]。張麗珍等[36]研究發(fā)現(xiàn)在MS基本培養(yǎng)基中添加4%蔗糖、0.75%瓊脂、1.0mg/L6-BA和0.08%碳粉能有效控制青蒿組織培苗的玻璃化現(xiàn)象，使增殖系數(shù)較高，玻璃化率相對(duì)較低，組培苗也較健壯，移栽成活率高。適當(dāng)降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和赤霉素的濃度也有利于減輕玻璃化的現(xiàn)象。許多研究發(fā)現(xiàn)表明繼代培養(yǎng)中所累積的高濃度的細(xì)胞分裂素是導(dǎo)致試管苗玻璃化的主要因素[37]。利用固體培養(yǎng)，增加瓊脂濃度，降低培養(yǎng)基的襯質(zhì)勢(shì)，造成細(xì)胞吸水阻遏。提高瓊脂純度，也可降低玻璃化[34]。并且瓊脂濃度為0.6%時(shí)，玻璃化程度最低[38-39]。3展望隨著植物組培技術(shù)的備受關(guān)注，其研究領(lǐng)域也在不斷擴(kuò)大?，F(xiàn)已逐漸擴(kuò)展到分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、組織學(xué)、胚胎學(xué)、園藝學(xué)、育種學(xué)等方面。特別是近30年，植物組培技術(shù)在理論上和實(shí)際運(yùn)用上已經(jīng)越來越成熟。從植物的快速繁殖，花藥的離體培養(yǎng)到細(xì)胞器培養(yǎng)，原生質(zhì)融合以及DNA重組技術(shù)都證明了組培技術(shù)的逐步成熟和完善，如何解決組織培養(yǎng)過程中存在的問題顯得尤為重要。4參考文獻(xiàn)[1]趙蓬暉，張江濤，馬紅衛(wèi).植物組織培養(yǎng)中的幾個(gè)常見問題與對(duì)策[J].河南林業(yè)科技，2001，21（2）：27-28.[2]周俊輝，周厚高，劉花全.植物組織培養(yǎng)中的內(nèi)生菌污染問題[J].廣西植物，2003，23（1）：41-47.[3]柴向華，李軍，張秀珊，等.植物組織培養(yǎng)中污染的控制[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（6）：40-44.[4]朱文祥，王金榮，李珺，等.植物組織培養(yǎng)中外植體褐變研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（31）：17399-17401.[5]劉淑玉，祁東文，馮文偉.如何克服組織培養(yǎng)中試管苗玻璃化問題[J].新疆林業(yè)，2001（1）：15.[6]卜學(xué)賢，陳維倫.試管植物的玻璃化現(xiàn)象[J].植物生理學(xué)通訊，1987（5）：13-18.[7]牟彤，吳瑕，胡鑫宇.不同激素條件對(duì)草莓組培苗快繁的影響[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，16（5）：78-79.[8]鄒英寧，吳強(qiáng)盛.果樹組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象及其抑制研究進(jìn)展[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)，2007（9）：47-50.[9]鄒瑜，林貴美，韋華芳，等.四種方法對(duì)組培室空氣消毒效果的研究[J].北方園藝，2009（8）：117-119.[10]袁源，何瑞，詹若挺.青天葵組培擴(kuò)繁中的污染控制初探[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2010（2）：25-27.[11]李穎，李春燕.多菌靈和青霉素在組培污染中的應(yīng)用[J].林業(yè)科技，2002（1）：6-8.[12]李曉鶯，羅青，張曦燕，等.殺菌劑對(duì)枸杞組織培養(y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